receptor，Di_CAR)基因重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞(Natural killer cells,NK)； 所述双特异性嵌合抗原受体(D1-CAR)基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得D1-CAR-NK细胞;通过荧光定量PCR技术检测，转染了D1-CAR病毒载体的NKs其表达D1-CAR基因高于未转染的NKs为50倍以上； 所获得的自然杀伤细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员7和纤连蛋白变异体的肿瘤细胞，并抑制自然杀伤细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性;其高表达其特异标志物CD16+/CD56+，阳性率高于80%以上，激活性受体阳性率超过80%以上，而抑制性受体阳性率低于10%以下。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纤连蛋白变异体的特异嵌合抗原受体基因，包括纤连蛋白变异体的单链抗体并链接了特异结合抑制性受体基因启动子的转录因子突变体(c-Myc突变体)的基因片段。3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述的含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的特异嵌合抗原受体基因，包括特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域和CD3G胞内信号区的基因片段;所述两个共刺激分子为⑶28和⑶137。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述双特异性嵌合抗原受体基因之间链接了弗林蛋白酶切割位点，其在细胞内蛋白翻译后可产生两个独立发挥功能的嵌合抗原受体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。6.一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于， 将两个特异性嵌合抗原受体基因，即人IFN γ -信号肽-scFV(SLAMF7)-⑶8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及ScFv(FNv)-1gD铰链区-c_Myc突变体通过Furin切割位点和连接序列连接在一起，形成重组基因序列，序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA JPD1-CAR; 将D1-CAR的目的DNA片段和pUC229载体Hind III/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合D1-CAR大小和序列后，将测序正确的菌液转接于1ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置_80°C超低温冰箱中长期保存； 将D1-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体Hind III/BamH I双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆的PCR鉴定和测序鉴定； 取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个1cm的培养皿6X 16个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养液，换5ml Opt1-MEM培养液;取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opt1-MEM中，轻轻混匀，取36μ1 lipof ectamine2000加入1.5ml Opt1-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min ；混合质粒溶液和I ipofectamine 2000稀释液，置室温20min ；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37 °C,5% CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入I Oml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10 %血清的细胞培养基20ml，于37°C、含5 % CO2培养箱内继续培养48_72h ； 根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心1min，除去细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2Ε+8 TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱； 所述双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA(D1-CAR)构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得D1-CAR-NK细胞;通过荧光定量PCR技术检测，转染了D1-CAR病毒载体的NKs其表达D1-CAR基因高于未转染的NKs为50倍以上； 所获得自然杀伤细胞，其高表达其特异标志物CD16+/CD56+，阳性率高于80 %以上，激活性受体阳性率超过80%以上，而抑制性受体阳性率低于10%以下。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于， 采集来源于患者自体外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用RPMI1640培养基重悬并稀释到2-5 X 16细胞/ml，并补充l-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l-500ng/ml IL-18、10_2000IU/ml IL-2和 10% 自体血清，每孔I.2ml加入到小鼠抗人⑶16包被的24孔板中，于37°C、含5^^02培养箱内继续培养到第5天;第5天离心收获NK细胞，并通过苔盼兰计数。 第5天以3 X 16细胞/ml NK细胞加入到六孔培养板，每孔为2ml，于37 °C、含5 % CO2培养箱内培养过夜；第6天将20μ1 1Ε+7 TU/ml重组D1-CAR慢病毒加入到人NK的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37°(:、5^^02的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液RPMI 16404ml，所述完全培养液优选含l-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、卜500ng/ml IL-18、10-2000活性单位(IU)/ml IL-2和10%自体血清；当NK细胞生长密度达到6 X 16细胞/ml时，转入75cm2培养瓶中生长，6孔对应I个培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到50ml培养体系；于37°C、含5 % CO2培养箱内培养到第15-21天，期间根据NK细胞密度和培养基颜色变化补充含10-2000IU/ml IL-2和10%自体血清新鲜完全培养液RPMI 1640，并扩瓶到175cm2培养瓶中或转移到I.5L培养袋中生长； 培养到第21天的NK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了D1-CAR病毒载体的NKs其表达D1-CAR基因高于未转染的NKs为50倍以上；蛋白印迹技术检测其D1-CAR融合蛋白表达水平，可表达80卩￥(51^1^7)气厶1? 53kDa和scFv(FNv)-CAR 42kDa的融合蛋白。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中培养获得自然杀伤细胞，高表达其特异标志物⑶16+/⑶56+阳性率高于85%以上，激活性受体阳性率超过80%以上，而抑制性受体阳性率低于10%以下，所述的自然杀伤细胞引发抗体依赖性的细胞毒性活性，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。9.一种制备双特异性嵌合抗原受体基因的自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括； (1)获得权利要求1-8任一项所述的稳定表达D1-CAR的病毒载体； (2)NK细胞因子，包括几-15、几-12、几-18和11^-2; (3)鼠抗人⑶16包被24孔板； (4)淋巴细胞培养基，包括RPMI1640或无血清培养基； (5)淋巴细胞分离液； (6)生理盐水； (7)使用说明书； 其中，所述使用说明书包括权利要求1-8中任一项所述的方法。10.权利要求1-9中任一项所述双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其中包括如下特征：构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7以及纤连蛋白变异体的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员7和纤连蛋白变异体的肿瘤细胞，并抑制自然杀伤细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避；同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，在体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性；本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞制备的试剂盒，可获得高表达该双特异性嵌合抗原受体基因并引发强大的抗肿瘤效应。
【IPC分类】A61K35/17, C12N5/10, C12N15/86, A61P35/00, C12N15/62
【公开号】CN105647873
【申请号】
【发明人】陈建勋, 黄启明
【申请人】紫程瑞生会(北京)生物技术发展有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月14日