l IL-15、l_500ng/ml IL_12、1_500ng/ml IL-18和10_2000IU/ml IL-2。
[0021]本发明还提供了一种制备双特异性嵌合抗原受体基因的自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
[0022](I)获得如上所述的稳定表达D1-CAR的病毒载体；
[0023](2)NK 细胞因子，包括 11^-15、11^-12、11^-18和11^-2;
[0024](3)鼠抗人CD16包被24孔板；
[0025](4)淋巴细胞培养基，包括RPMI 1640或无血清培养基；
[0026](5)淋巴细胞分离液；
[0027](6)生理盐水；
[0028](7)使用说明书；
[0029]其中，所述使用说明书包括如上所述的方法。
[0030]本发明还提供了上述方法及其试剂盒制备NK细胞，可用于黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脉络膜黑色素瘤的免疫治疗。
【附图说明】
[0031]图1表示为构建的双特异性嵌合抗原受体融合蛋白示意图；
[0032]图2表示为实施例二制备的D1-CAR慢病毒转染NK细胞后培养到21天后其的表达水平；
[0033]图3表示为蛋白印迹技术检测实施例二制备的D1-CAR融合蛋白在D1-CAR慢病毒转染NK细胞中表达水平；
[0034]图4表示为实施例二制备的黑色素瘤患者D1-CAR慢病毒转染NK细胞流式细胞检测；
[0035]图5表示为实施例二制备的晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者来源D1-CAR慢病毒转染NK细胞对A875的杀伤活性；
[0036]图6表示为实施例二制备的晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者来源D1-CAR慢病毒转染NK细胞对MUM-2B的杀伤活性；
[0037]图7表示为荷葡萄膜黑色素瘤MUM-2BSCID鼠模型NK细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线。
【具体实施方式】
[0038]本发明发现特异结合SLAMF7以及FNv的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员7和纤连蛋白变异体的肿瘤细胞，并抑制自然杀伤细胞抑制性受体表达，避免了肿瘤细胞免疫逃避；同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验中激活了强烈地抗肿瘤应答。
[0039]对本发明涉及的一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法进行具体说明。
[0040]本发明涉及一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成含特异结合SLAMF7以及FNv的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员7和纤连蛋白变异体的肿瘤细胞，并抑制自然杀伤细胞抑制性受体表达，避免了肿瘤细胞免疫逃避；同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验中激活了强烈地抗肿瘤应答。
[0041 ]本发明所述双特异嵌合抗原受体基因中SLAMF7以及FNv单链抗体特异结合恶性肿瘤细胞表达的SLAMF7以及FNv抗原，使得NK细胞产生抗肿瘤的靶向特异性，优选地，为靶向黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脉络膜黑色素瘤等。
[0042]本发明所述的纤连蛋白变异体的特异嵌合抗原受体基因，包括纤连蛋白变异体的单链抗体并链接了特异结合抑制性受体基因启动子的转录因子突变体(c-Myc突变体)的基因片段，抑制自然杀伤细胞表达抑制性受体，避免了肿瘤细胞免疫逃避，其高表达激活性受体特异结合肿瘤细胞表面配体而产生细胞毒性作用。所述转录因子c-Myc突变体，优选地，将该基因cl641位点突变为g，即亮氨酸(Leu362)突变为缬氨酸，可结合KIR基因上游启动子并抑制了其转录。
[0043]本发明所述的含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的特异嵌合抗原受体基因，包括特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域(CD28和CD137)和CD3G胞内信号区的基因片段，可激活第一信号和共刺激信号，SP激活机体免疫应答而引发抗肿瘤细胞毒性活性和肿瘤凋亡作用。
[0044]同时所述双特异性嵌合抗原受体基因之间链接了弗林蛋白酶切割位点，其在细胞内蛋白翻译后可产生两个独立发挥功能的嵌合抗原受体。
[0045]本发明所述将人IFNy-信号肽-scFv(SLAMF7)-CD8a 铰链区-CD28-CD137-CD3G 胞内区，以及ScFv(FNv)-1gD铰链区-c-Myc突变体通过Furin切割位点和连接序列(Linker)连接在一起，形成重组基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA，S卩D1-CAR。
[0046]将两个特异性嵌合抗原受体基因，即人IFNy -信号肽-scFV(SLAMF7)-⑶8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及ScFv(FNv)-1gD铰链区-c-Myc突变体通过Furin切割位点和连接序列连接在一起，形成重组基因序列，序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA，S卩D1-CAR;
[0047]将D1-CAR的目的DNA片段和pUC229载体Hind III/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合D1-CAR大小和序列后，将测序正确的菌液转接于1ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置_80°C超低温冰箱中长期保存；
[0048]将D1-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体HindIII/BamH I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
[0049]取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个1cm的培养皿6 X 16个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养液，换5ml Opt1-MEM培养液；取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpt1-MEM中，轻轻混匀，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opt1-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min ；混合质粒溶液和I ipofectamine 2000稀释液，置室温20min ；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37°C、5 %CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入1ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10%血清的细胞培养基20ml，于37°C、含5%⑶2培养箱内继续培养48-72h；
[0050]根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬;经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱。
[0051]本发明所述方法中自然杀伤细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
[0052]采集来源于患者自体外周血，经淋巴细胞分离液分离纯化得到单个核细胞后，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到2-5\106细胞/1111，并补充1-500即/1111 IL-15、l_500ng/mlIL-12、l-500ng/ml IL-18、10-2000活性单位(IU)/ml IL-2和 10% 自体血清，每孔I.2ml加入到小鼠抗人CD 16包被的24孔板中，于37 °C、含5% CO2培养箱内继续培养到第5天。第5天离心收获NK细胞，并通过苔盼兰计数。
[0053]第5天以3 X 16细胞/ml NK细胞加入到六孔培养板，每孔为2ml，于37°C、含5%CO2培养箱内培养过夜。第6天将20μ1 lE+7TU/ml重组D1-CAR慢病毒加入到人NK的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37 °C、5 %⑶2的培养箱中孵育8_12个小时后，更换完全培养液RPMI1640 4ml，所述完全培养液含l-500ng/ml IL-15、卜500ng/ml IL-12、l_500ng/ml IL-18、10-2000活性单位(IU)/ml IL-2和10%自体血清；当NK细胞生长密度达到6 X 16细胞/ml时，转入75cm2培养瓶中生长，6孔对应I个培养瓶，补充完全培养液RPMI 1