一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法及其试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法及其试剂盒，其中包括如下特征:构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7(Signaling Lymphocytic Activat1n Molecule Family ,Member 7，SLAMF7)以及纤连蛋白变异体(fibronectin variant，FNv)的双特异嵌合抗原受体(double chimeric antigenreceptor，D1-CAR)基因重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞(NaturaI killercells，NK)，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员7和纤连蛋白变异体的肿瘤细胞，并抑制自然杀伤细胞抑制性受体表达，避免了肿瘤细胞免疫逃避；同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性;本发明还提供了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞制备的试剂盒，可获得高表达该双特异性嵌合抗原受体基因并引发强大的抗肿瘤效应。
【背景技术】
[0002]自然杀伤细胞是目前在国内进行临床治疗常见的免疫细胞技术。目前NK细胞主要通过滋养细胞或者抗体激活诱导作用获得的，表达CD16+CD56+阳性细胞。其抗肿瘤主要机制为通过其表达激活性受体与肿瘤细胞膜上配体结合，释放颗粒酶和穿孔素直接杀死肿瘤细胞，以及高表达的CD16分子引发抗体依赖性细胞毒性活性对肿瘤细胞产生凋亡作用。
[0003]然而，NK细胞在临床上治疗恶性肿瘤方面疗效还有限，根据临床治疗数据统计包括肿瘤完全消失的完全缓解和肿瘤部分缩减的部分缓解的有效率在40-50%之间，还远远不能满足临床治疗恶性肿瘤的需要。影响NK细胞治疗癌症的效果的关键问题是NK细胞靶向肿瘤细胞杀伤特异性差，以及其表达抑制性受体，使得肿瘤细胞可以通过结合其产生免疫逃逸。目前提高NK细胞数量、CD16+⑶56+表型和降低抑制性受体表达，均已有研究开展，以有效提尚其治疗癌症的有效率。
[0004]本发明提供了以结合肿瘤细胞特异表达的SLAMF7以及FNv的双特异嵌合抗原基因重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员7和纤连蛋白变异体的肿瘤细胞，如黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脉络膜黑色素瘤等均特异表达SLAMF7以及FNv两个肿瘤抗原;并抑制自然杀伤细胞抑制性受体表达，避免了肿瘤细胞免疫逃避；同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性，将显著提高临床疗效和延长患者生存期。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有临床应用NK细胞技术的不足，特别是因NK细胞靶向肿瘤细胞杀伤特异性差;NK细胞表达抑制性受体，使得肿瘤细胞可以通过结合其产生免疫逃逸，以及在体内激活患者自身免疫作用抗肿瘤不足，因而造成杀瘤活性低和大多数恶性肿瘤治疗有限。本发明在前期研究工作中发现黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脉络膜黑色素瘤等均特异表达两个肿瘤抗原SLAMF7和FNv，根据这两个肿瘤抗原的胞外区通过杂交瘤技术获得与两者特异性结合反应的单克隆细胞株和单克隆抗体，蛋白测序确定单克隆抗体的重链和轻链的可变区，利用基因PCR技术将重链和轻链通过链接子(Iinker)连接产生单链抗体(singlechain antibody fragment, scFv)，在酶联免疫法和细胞流式检测该两个scFv能特异结合SLAMF7和FNv两个肿瘤抗原，肿瘤细胞为黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脉络膜黑色素瘤等，这两个scFv可以作为结合SLAMF7和FNv两个肿瘤抗原的抗体。
[000?]本申请发明人发现转录因子-原癌基因c-My c结合NK细胞抑制性受体(killercell immunoglobulin-like receptor，KIR)表达启动子，启动NK细胞KIR的表达而介导肿瘤细胞的免疫逃逸功能。我们发现将c-Myc中362位点亮氨酸突变为缬氨酸产生的c-Myc突变体，可以与KIR基因表达启动子结合，但KIR基因不表达，表明该c-Myc突变体可抑制KIR基因表达，从而阻止了 NK细胞表达抑制性受体介导的免疫逃逸作用。因而我们根据这些科研结果，构建成含特异结合SLAMF7以及FNv的双特异嵌合抗原受体基因，并引入c-Myc突变体以及⑶28、CDl37和⑶3ζ胞内信号区的基因片段，重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，体内体外试验抗肿瘤具有很强杀伤毒性。
[0007]本发明涉及一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成含特异结合SLAMF7以及FNv的双特异嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染人自然杀伤细胞，高表达该双特异性嵌合抗原受体基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员7和纤连蛋白变异体的肿瘤细胞，并抑制自然杀伤细胞抑制性受体表达，避免了肿瘤细胞免疫逃避；同时激活第一信号和共刺激信号而引发抗肿瘤细胞毒性活性，体内体外试验中激活了强烈地抗肿瘤应答。
[0008]所述双特异性嵌合抗原受体基因的cDNA(D1-CAR)构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得D1-CAR-NK细胞，通过荧光定量PCR技术检测，转染了D1-CAR病毒载体的NKs其表达D1-CAR基因高于未转染的NKs为50倍以上；
[0009]所获得自然杀伤细胞，其高表达其特异标志物⑶16+/⑶56+，阳性率高于80%以上，激活性受体阳性率超过80 %以上，而抑制性受体阳性率低于1 %以下。
[0010]本发明所述双特异嵌合抗原受体基因中SLAMF7以及FNv单链抗体特异结合恶性肿瘤细胞表达的SLAMF7以及FNv抗原，使得NK细胞产生抗肿瘤的靶向特异性，优选地，为靶向黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤和脉络膜黑色素瘤等。
[0011]本发明所述的纤连蛋白变异体的特异嵌合抗原受体基因，包括纤连蛋白变异体的单链抗体并链接了特异结合抑制性受体基因启动子的转录因子突变体(c-Myc突变体)的基因片段，抑制自然杀伤细胞表达抑制性受体，避免了肿瘤细胞免疫逃避，其高表达激活性受体特异结合肿瘤细胞表面配体而产生细胞毒性作用。所述转录因子c-Myc突变体，优选地，将该基因cl641位点突变为g，即亮氨酸(Leu362)突变为缬氨酸，可结合KIR基因上游启动子并抑制了其转录。
[0012]本发明所述的含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的特异嵌合抗原受体基因，包括特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7的单链抗体并串联了两个共刺激分子胞内域(CD28和CD137)和CD3G胞内信号区的基因片段，可激活第一信号和共刺激信号，SP激活机体免疫应答而引发抗肿瘤细胞毒性活性和肿瘤凋亡作用。
[0013]同时所述双特异性嵌合抗原受体基因之间链接了弗林蛋白酶切割位点，其在细胞内蛋白翻译后可产生两个独立发挥功能的嵌合抗原受体。
[0014]本发明所述方法中自然杀伤细胞来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
[0015]本发明所述将人IFNy-信号肽-scFv(SLAMF7)-CD8a 铰链区-CD28-CD137-CD3G 胞内区，以及ScFv(FNv)-1gD铰链区-c-Myc突变体通过Furin切割位点和连接序列连接在一起，形成重组基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因的。0嫩，8口0^八1?。
[0016]将D1-CAR构建在病毒载体中，并转染患者自体NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得D1-CAR-NK细胞。通过荧光定量PCR技术检测，转染了D1-CAR病毒载体的NKs其表达D1-CAR基因高于未转染的NKs为50倍以上。蛋白印迹技术检测其D1-CAR融合蛋白表达水平，可
53kDa和scFv(FNv)-CAR 42kDa的融合蛋白。
[0017]本发明所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得自然杀伤细胞，增殖倍数达1000倍以上，培养到21天自然杀伤细胞数达3 X 19以上。
[0018]本发明所述方法中培养获得的自然杀伤细胞，高表达其特异标志物⑶16+/⑶56+，阳性率高于80%以上，激活性受体阳性率超过80%以上，而抑制性受体阳性率低于10%以下，所述的自然杀伤细胞引发抗体依赖性的细胞毒性活性，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
[0019]本发明使用的NK细胞激活培养器为使用小鼠抗人CD16单克隆抗体包被的培养板，包括48孔板、24孔板、12孔板、6孔板和培养瓶，优选地为24孔板。
[0020]本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入含1-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l_500ng/ml IL-18、10-2000活性单位(IU)/ml IL-2和10 % (体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如CellGro SCGM、A頂_V、X_VIV0和GT-T551 等，含有l_500ng/m