-2和 10% 自体血清)，于37°C、含5%⑶2培养箱内培养过夜。第6天将20μ1 lE+7TU/ml重组D1-CAR慢病毒加入到人NK的六孔培养板中，体系为2ml，混匀，37 °C、5 % ω2的培养箱中孵育8-12个小时后，更换完全培养液RPMI 16404ml，所述完全培养液含50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、lOOIU/ml IL-2和10%自体血清；当NK细胞生长密度达到6 X 16细胞/ml时，将NK细胞转移到1.5L培养袋中生长75cm2培养瓶，补充完全培养液RPMI 1640到10ml培养体系；于37°C、含5%C02培养箱内培养到第21天，期间根据NK细胞密度和培养基颜色变化补充完全培养基RPMI 1640(含50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、100IU/ml IL-2和 10% 自体血清)。
[0086]图2为D1-CAR慢病毒转染NK细胞后培养到21天后其的表达水平。在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书(美国Invitrogen公司)检测，培养到第21天的NK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了D1-CAR病毒转染晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者的NKs其表达D1-CAR基因分别高于未转染的NKs为68.9和59.5倍。CAR-mNK为D1-CAR慢病毒转染的黑色素瘤患者来源NK细胞，CAR-uNK为D1-CAR慢病毒转染的葡萄膜黑色素瘤患者来源NK细胞，Blank-mNK为空白慢病毒转染的黑色素瘤患者来源NK细胞，Blank_uNK为空白慢病毒转染的葡萄膜黑色素瘤患者来源NK细胞，mNK为黑色素瘤患者来源NK细胞，uNK为葡萄膜黑色素瘤患者来源NK细胞。
[0087]实施例三
[0088]双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞蛋白印迹和流式细胞检测
[0089]取实施例二制备的晚期黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤患者和正常健康人来源第15天培养获得的NK细胞各I X 106，通过超声破碎后进行蛋白凝胶电泳。根据目的蛋白的分子量，配制10%分离胶，浓缩胶浓度为5%。待检测蛋白样品上样量:20yg/孔。电泳条件:浓缩胶恒压90V，约20分钟；分离胶恒压120V，通过标准分子量预染蛋白来确定电泳停止时间。湿转法，转膜条件:300mA恒流;0.45μπι孔径PVDF膜，转膜时间80分钟。转膜完成后丽春红染色试剂对膜进行染色，观察转膜效果。封闭:将膜完全浸没于5 % (mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)的转膜缓冲液(含体积比3 %吐温-20，TBST)中，室温下水平摇床孵育I小时。一抗孵育:5 %(mg/mL)BSA-TBST稀释链霉亲和素标记的山羊抗小鼠IgG(H+L) 1:2000，购自上海碧云天生物技术有限公司；4 °C水平摇床孵育过夜。次日，洗膜:TBST洗3次，每次10分钟。化学发光底物ECL滴加到膜的蛋白面，反应3-5分钟;胶片曝光:10秒-5分钟(曝光时间随不同光强度而调整)，显影2分钟，定影。
[0090]胶片用扫描仪扫描为大于300DPI的TIF格式图片，使用QuantityOne分析软件(B1-Rad公司)进行灰度分析，图3为蛋白印迹技术检测D1-CAR融合蛋白在D1-CAR慢病毒转染晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者来源的NK细胞，以及D1-CAR融合蛋白大肠杆菌中表达水平(阳性对照)，即western blotting结果图，在两例患者中均出现两条带，其中一条为SLAMF7-CAR，约为482氨基酸残基，分子量约为53kD ；另一条为FNv-CAR，约383氨基酸残基，分子量约为42kD。第I条带为D1-CAR慢病毒转染晚期黑色素瘤NK细胞，第2条带为D1-CAR慢病毒转染晚期萄膜黑色素瘤NK细胞，第3条带为D1-CAR融合蛋白大肠杆菌中表达，条带分子量约为95kD，即SLAMF7-CAR和FNv-CAR分子量之和。
[0091]取实施例二制备的晚期黑色素瘤、葡萄膜黑色素瘤患者和正常健康人来源第15天培养获得的I X 16NK细胞，进行流式抗体染色检测分析。NK细胞第一组分别为20yL鼠抗人CD16-FITC、20yL 鼠抗人 CD56-PE 和 20yL 鼠抗人 CD3-PerCP;第二组分别为 20yL 鼠抗人 NKG2D-FITC、20yL鼠抗人NKp46-PE和20yL鼠抗人KIR3DLl-PerCP;同型对照组为20yL mlgGl-FITC、20yL mlgGl-PE和20yL mlgGl-PerCP;放置4°C冰箱染色30分钟后用PBS洗涤3次，然后在FACS Cal ibur仪器(美国BD公司)上机检测和分析。
[0092]图4为实施例二制备的黑色素瘤患者D1-CAR慢病毒转染NK细胞流式细胞检测，该NK细胞⑶16和⑶56阳性率为94.44 %，⑶3阳性率为3.4%；激活性受体NKG2D和NKp46阳性率分别为93.04 %和75.84%；抑制性受体KIR3DL1阳性率为8.13%。实施例二制备的葡萄膜黑色素瘤患者和正常人D1-CAR慢病毒转染NK细胞⑶16和⑶56阳性率均超过85%以上，CD3阳性率低于10% ;激活性受体NKG2D和NKp46阳性率分别高于75%以上;抑制性受体KIR3DL1阳性率低于10%以下。而未转染的NK细胞⑶16和⑶56阳性率均也超过85%以上，CD3阳性率也低于10%;激活性受体NKG2D和NKp46阳性率也分别高于65%以上;但抑制性受体KIR3DL1却高表达，阳性率超过50 %以上。
[0093]实施例四
[0094]双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞体外杀瘤试验
[0095]分别以黑色素瘤细胞系A875和葡萄膜黑色素瘤细胞系MUM-2B为靶细胞，以实施例二中制备的D1-CAR慢病毒转染NK细胞作为效应细胞，按效靶比40:1、20:1、10:1、5:1和2.5:1分别加入96孔培养板中，然后置于37°C、5%C02条件下培养4h，均设3个复孔。采用LDH细胞毒实验法测定NK活性:吸取上清液50yL，置于96孔板中，加入LDH基液50yL，室温避光30min，加入50yL终止液终止反应，490nm波长处测吸光度(OD)值。按下列公式分别计算PC-3和MCF-7细胞的杀伤率:杀伤率=(实验组OD值-效应细胞自然释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)/(靶细胞最大释放组OD值-靶细胞自然释放组OD值)X 100%。
[0096]图5为晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者来源D1-CAR慢病毒转染NK细胞对A875的杀伤活性，随着效靶比提高，细胞毒性活性也不断提高，D1-CAR慢病毒转染黑色素瘤患者NK细胞杀伤A875杀伤毒性显著高于未转染的NK细胞，P值为0.016，而与D1-CAR慢病毒转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞相比较无差异。图6为晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者来源D1-CAR慢病毒转染NK细胞对MUM-2B的杀伤活性，随着效靶比提高，细胞毒性活性也不断提高，D1-CAR慢病毒转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞杀伤MUM-2B杀伤毒性显著高于未转染的NK细胞，P值为0.021，而与D1-CAR慢病毒转染黑色素瘤患者NK细胞相比较无差异。
[0097]实施例五
[0098]双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞体内杀瘤实验中的作用
[0099]24只8周SCID裸鼠腹部侧翼皮下注射5 X 16葡萄膜黑色素瘤系MUM-2B，饲养7天后，随机分为A、B、C和D 4组，每组6只:A组为实施例二制备的D1-CAR慢病毒转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞治疗组;B组为实施例二制备的空白慢病毒转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞治疗组;C组为实施例二制备的未转染的葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞治疗组;D组为生理盐水安慰剂组。A组在D1-CAR慢病毒转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2X 14细胞/克，B组在空白慢病毒转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞培养到第
14天和第16天尾静脉注射2 X 14细胞/克，C组在未转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞培养到第14天和第16天尾静脉注射2X 14细胞/克，D组与A、B和C治疗组同时间，尾静脉注射同体积的生理盐水，各lmL。治疗后分别于7d、14d、21d、28d和35d拉颈处死，取荷前列腺癌MUM-2BSCID鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型荷瘤大小。
[0100]图7荷葡萄膜黑色素瘤MUM-2BSCID鼠模型NK细胞治疗完之后肿瘤大小变化曲线，生理盐水组D和CAR-uNK治疗组A、Blank-uNK治疗组B与uNK治疗组C相比，治疗组A、治疗组B与治疗组C中葡萄膜黑色素瘤肿瘤大小缩少，但治疗组A与治疗组B与治疗组C相比葡萄膜黑色素瘤肿瘤大小缩少更为明显，P值分别为0.004和0.006，表明D1-CAR慢病毒转染葡萄膜黑色素瘤患者NK细胞弓I发了强大的体内杀瘤活性。
【主权项】
1.一种双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备方法，其特征在于，构建成含特异结合信号淋巴细胞激活分子家族成员7(Signaling Lymphocytic Activat1nMolecule Family ,Member 7，SLAMF7)以及纤连蛋白变异体(f ibronectin variant，FNv)的双特异性嵌合抗原受体(double chimeric antigen