640到50ml培养体系；于37°C、含5 % CO2培养箱内培养到第15-21天，期间根据NK细胞密度和培养基颜色变化补充含10-2000IU/ml IL-2和10%自体血清新鲜完全培养液RPMI 1640，并扩瓶到175cm2培养瓶中或转移到I.5L培养袋中生长。
[0054]培养到第21天的NK细胞通过荧光定量PCR技术检测，转染了D1-CAR病毒载体的NKs其表达D1-CAR基因高于未转染的NKs为50倍以上。蛋白印迹技术检测其D1-CAR融合蛋白表达水平，可表达80?￥(51^1^7)气41? 53kDa和scFv(FNv)-CAR 42kDa的融合蛋白。
[0055]本发明所述方法中来源30ml外周血单个核细胞诱导培养获得自然杀伤细胞，增殖倍数达1000倍以上，培养到21天自然杀伤细胞数达3 X 19以上。
[0056]本发明所述方法中培养获得的自然杀伤细胞，高表达其特异标志物⑶16+/⑶56+，阳性率高于80%以上，激活性受体阳性率超过80%以上，而抑制性受体阳性率低于10%以下，所述的自然杀伤细胞引发抗体依赖性的细胞毒性活性，体内体外试验具有很强抗肿瘤杀伤毒性。
[0057]本发明使用的NK细胞激活培养器为使用小鼠抗人CD16单克隆抗体包被的培养板，包括48孔板、24孔板、12孔板、6孔板和培养瓶，优选地为24孔板。
[0058]本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI1640培养基加入含1-500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l_500ng/ml IL-18、10-2000活性单位(IU)/ml IL-2和10 % (体积比)自体血清或胎牛血清，优选地，细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基，如CellGro SCGM、A頂_V、X_VIV0和GT-T551 等，含有含l_500ng/ml IL-15、l_500ng/ml IL-12、l-500ng/ml IL-18和10_2000IU/ml IL-2。
[0059]本发明还提供了一种制备双特异性嵌合抗原受体基因的自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:
[0060](I)获得如上所述的稳定表达D1-CAR的病毒载体；
[0061](2)NK 细胞因子，包括 IL-15、IL-12、IL-18 和 IL-2;
[0062]⑶鼠抗人CD 16包被24孔板；
[0063](4)淋巴细胞培养基，包括RPMI 1640或无血清培养基；
[0064](5)淋巴细胞分离液；
[0065](6)生理盐水；
[0066](7)使用说明书；
[0067]其中，所述使用说明书包括如上所述的方法。
[0068]作为本发明NK细胞增殖培养中使用的细胞培养板、细胞培养皿、培养瓶、细胞培养袋，可例举为75cm2细胞培养瓶、175cm2细胞培养瓶、225cm2细胞培养瓶、IL或2L细胞培养袋等细胞培养用器材(容器)，均可用于本发明，优选细胞培养袋。
[0069]本发明的制造方法中对NK细胞进行冻存，对冻存液无特殊限制，但优选例如为50 %小牛血清、40 %细胞培养液和1 % 二甲基亚砜，其中细胞培养液更优选为NK细胞培养液。
[0070]在培养基中可以添加血清或血浆进行培养。它们在培养基中的添加量不受特殊限制，如大于O容量％至20容量％，且可以根据不同的培养阶段而改变血清或血浆的用量，优选为5% (体积比)。例如，可以阶段性减少血清或血浆浓度来使用。另外，作为血清或血浆的来源，可以是自己(意味着与所培养的细胞来源相同)或非自己(意味着与所培养的细胞的来源不同)中的任一种，从安全性的观点出发，优选自己来源的血清或血浆。另外，也可以添加如人血清白蛋白之类经分离纯化的血清成分。
[0071 ]本发明的自体NK细胞增殖的制备使用上述各种成分及培养基来实施。本发明中使用的培养培养条件也没有特殊限制，可以使用通常的细胞培养中使用的条件。例如，可在37°C、5%C02等条件下培养。还可以实施如下等操作:间隔适当的时间添加新鲜培养基来稀释细胞培养液，或更换培养基，或更换细胞培养用器材等。
[0072]本发明还提供NK细胞在临床应用中多次的抗肿瘤治疗，更好地在生物体内发挥抗肿瘤免疫应答，达到很好的治疗效果。此外，上述NK细胞还具有如下优点，多次NK细胞治疗将更好地引发NK细胞杀瘤活性，阻止了肿瘤细胞免疫逃逸，激活机体自身免疫应答，产生高效、长效地抗肿瘤免疫效应，因此非常利于患者疗效的提高和生存期的延长。
[0073]以下，结合实施例对本发明做更具体的描述，但本发明不限于此。
[0074]实施例一
[0075]重组D1-CAR基因构建及其慢病毒的制备
[0076]将人IFNy-信号肽-scFv(SLAMF7)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及ScFv(FNv)-1gD铰链区-c-Myc突变体通过Furin切割位点和连接序列的基因片段构成，C-Myc突变体的第362个亮氨酸突变为缬氨酸，S卩c-Myc-L/V，见图1，即D1-CAR融合蛋白示意图。
[0077]将人IFNy-信号肽-scFv(SLAMF7)-CD8a铰链区-CD28-CD137-CD3G胞内区，以及scFv(FNv)-1gD铰链区-c-Myc突变体通过Fur in切割位点和连接序列(Linker)连接在一起，形成重组基因序列，基因序列通过化学合成获得，形成完整的双特异性嵌合抗原受体基因^cDNAJPD1-CAR;
[0078]将D1-CAR的目的DNA片段和pUC229载体Hind III/BamHI双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于4°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定;PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合D1-CAR大小和序列后，将测序正确的菌液转接于1ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37°C培养过夜，用北京天根生物无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置_80°C超低温冰箱中长期保存;所述D1-CAR大小约为2607bp;
[0079]将D1-CAR的目的DNA片段和pFLAG-CMV-2载体HindIII/BamH I双酶切后，在T4DNA连接酶作用下，将两者于37°C、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；
[0080]取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，按照每个1cm的培养皿6 X 16个细胞数接种于培养皿中，37°C，5%C02的培养箱中培养过夜;第二天转染前移去培养液，换5ml Opt1-MEM培养液；取9yg包装混合液和3yg慢病毒表达质粒加入1.5mlOpt1-MEM中，轻轻混匀，取36μ1 lipofectamine2000加入1.5ml Opt1-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min ；混合质粒溶液和I ipofectamine 2000稀释液，置室温20min ；混合液缓慢滴加至293FT细胞的培养液中，混匀，于37°C、5 %CO2细胞培养箱中培养;培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入1ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃;缓慢加入含10 %血清的细胞培养基20ml，于37°C、含5 % CO2培养箱内继续培养72h。[0081 ] 根据细胞状态，收集转染后48h的293FT细胞上清液;于4°C，4000g离心lOmin，除去细胞碎片；以0.45μπι滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4°C;离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬;经充分溶解后，高速离心lOOOOrpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照50μ1 2E+8TU/ml分装，保存于-80°C超低温冰箱，即制备成了 D1-CAR慢病毒。
[0082]实施例二
[0083]双特异性嵌合抗原受体基因修饰的自然杀伤细胞的制备
[0084]采集晚期黑色素瘤和葡萄膜黑色素瘤患者30ml(与其签署知情同意书)，加入等量I X PBS稀释，沿离心管管壁轻轻叠加于淋巴细胞分离液上，形成明显界面，室温下2000rpm离心2011^11，吸取界面层的？81(:，用1\?83(?!1值为7.4)洗涤两次。苔盘兰计数后，用1^111640培养基重悬并稀释到3 X 16细胞/ml，用RPMI 1640培养基重悬并稀释到3 X 16细胞/ml，并补充50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、100IU/ml IL-2和 10% 自体血清，每孔1.2ml加入到小鼠抗人⑶16包被的24孔板中，于37°C、含5%⑶2培养箱内继续培养到第5天。第5天离心收获NK细胞，并通过苔盼兰计数。
[0085]第5天以3 X 16细胞/ml NK细胞加入到六孔培养板，每孔为2ml RPMI1640培养基(含50ng/ml IL_15、20ng/ml IL_12、20ng/ml IL-18、100IU/ml IL