活，包括纤维二糖(纤维素酶诱导物)的转运吸收相关基因以及主要的纤维素酶相关转录因子的上调表达。
[0070]实施例6、高产多基因突变菌株CPL9 ( A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)在纤维二糖及纤维素条件下的诱导产酶
6.1 杂交:以实施例1中CPL8 (A3^GAcdt2Ancu05853)(配型A)作为母本，以CRE-1 (NCU08807, FGSC 18633，配型a)作为父本进行杂交，方法见实施例1步骤1.1。
[0071]6.2提基因组DNA:方法见实施例1步骤1.2。
[0072]6.3 PCR验证筛选突变体
上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU 00130基因位点，序列为
5’ -GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3，.’下游引物NCU04952r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU04952 基因位点，序列为 5’-AACACACACACACACACTGG-3’ ；下游引物 NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU 08755基因位点，序列为5’ -GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’ ；下游引物8114Vr,为了验证潮霉素hph基因处在NCU08114基因位点，序列为5’ -GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；下游引物5853Vr，为了验证潮霉素hph基因处在NCU05853基因位点，序列为5’ -GAGCAAGGTTATAGGACTGC-3’ ；下游引物8807Vr，为了验证潮霉素hph基因处在NCU08807基因位点，序列为5’ -AGCCCTAACCAGTTACTACG-3’。PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤I。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引导下经PCR扩增获得了 1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引导下经PCR扩增获得了 1910bp目的条带，该条带表明NCU04952基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了 1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因已经被潮霉素hph基因替代。在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引导下经PCR扩增获得了 1857bp目的条带，该条带表明NCU08114基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物5853Vr的引导下经PCR扩增获得了 1677bp目的条带，该条带表明NCU05853基因已经被潮霉素hph基因替代。在上游引物hph5f和下游引物8807Vr的引导下经PCR扩增获得了 1854bp目的条带，该条带表明NCU08807基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因。通过筛选，获得了 CPL9(Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel), CPLlO ( Λ 2 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)。
[0073]6.4 CPL9 ( A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)在纤维二糖及纤维素条件下的诱导产酶分析
将以上构建得到CPL9突变菌株(A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)和CPL7(A3^GAcdt2Ancu05853)首先分别在 2% (2g/100mL)蔗糖培养基(配方:50XVoger s盐20mL，葡萄糖20g，定容体积到1L，高压灭菌。)上25 °C培养48小时后，然后转入2% (2g/100mL)的纤维二糖(CB)培养基25 °C继续培养7d，样品离心取上清液，测定蛋白浓度(Protein)和测定纤维素酶活(CMCase activity)。结果显示，CPL9(Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel)蛋白以及酶活都有显著的提高(图7和图8)，该突变体可以显著提升产酶和纤维素降解利用。
[0074]实施例7、高产多基因突变菌株CPLlO ( Λ 2 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)在纤维二糖及纤维素条件下的诱导产酶
将实施例6和实施例1中构建得到的CPLlO ( Δ 2 β G Δ cdt2 Δ ncu05853) Δ2β6首先分别在2% (2g/100mL)蔗糖培养基(配方:50X Vogel, s盐20mL，葡萄糖20g，定容体积到1L，高压灭菌。)上25°C培养48小时后，然后转入2% (2g/100mL)的纤维二糖(CB)或2%结晶纤维素(AviceI)培养基25°C继续培养7d，定时取样，测定蛋白浓度(Protein)。与A 2 β G相比较，无论在结晶纤维素还是纤维二糖条件下，CPL10( Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)蛋白产量都有显著的提高(图9)。此外，在纤维二糖诱导条件下，CPLlO中纤维素酶基因(NCU07340)和半纤维素酶相关转录因子(NCU06971)的表达水平都有显著提高(图10)。由此可知，CPLlO突变体相比Λ 2 β G能够显著提升产酶和纤维素降解利用。
【主权项】
1.用于生产纤维素酶或将生物质降解转化为糖或其他化学品的多基因突变菌株，其特征在于，含有敲除、突变或弱化表达clpl (ncu05853)基因，能够在纤维二糖以及纤维素诱导条件下高产纤维素酶系，以及生物质降解能力得到提升；为以下菌株之一: a.命名为CPL7(A3 0GAcdt2AncuO5853)的基因突变菌株，构建部分碱基突变或敲除或减弱纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β -葡萄糖苷酶基因NCUOO130、NCU04952和NCU08755的微生物菌株； b.命名为CPL9( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel)，构建部分碱基突变或敲除或减弱纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株； c.命名为CPLlO( Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)，构建部分碱基突变或敲除或减弱纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β -葡萄糖苷酶基因NCUOO130和NCU08755的微生物菌株； d.命名为CPLlI( Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel)，构建部分碱基突变或敲除或减弱纤维寡糖感应蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755以及碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株； 所述纤维寡糖转运类似蛋白CLPl (NCU05853)和纤维寡糖转运蛋白⑶T_2 (NCU08114)以及葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列如下:1)纤维寡糖转运类似蛋白CLPl (NCU05853)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示；NCU05853编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；2)纤维寡糖转运蛋白NCU08114的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3所示；纤维寡糖转运蛋白NCU08114编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.4所示；3) β -葡萄糖苷酶基因NCU00130的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU00130编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.6所示；4) β -葡萄糖苷酶基因NCU04952的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.7所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU04952编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.8所示；5) β -葡萄糖苷酶基因NCU08755的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.9所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU08755编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ IDN0.10所示；6)碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.11所示；碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.12所示。2.一种利用组合敲除CLP1(NCU05853)以及其他基因(包括纤维寡糖转运蛋白CDTl或CDT2;葡萄糖苷酶基因(一个或多个葡萄糖苷酶基因:NCU00130, NCU04952, NCU08755, NCU03641, NCU08054, NCU07487, NCU05577)和碳分解代谢物阻遏蛋白 CRE-1 (NCU08807)中的不同组合.获得及促进微生物纤维素酶系分泌能力，获得或促进微生物水解生物质纤维素或半纤维素的方法，可将纤维素水解为纤维寡糖，将半纤维素水解为木寡糖木糖阿拉伯糖等，得到的重组微生物菌株与出发菌株相比，重组菌株获得或提高纤维素酶分泌能力及生物质水解能力。3.以权利要求1或2提及的多基因突变菌株Λ3β6Λcdt2 Δ ncu05853,Δ 2 β G Δ c d t 2 Δ ncu05853, Δ 3 β G Δ c d t 2 Δ ncu05853 Δ crel,Λ 2 β G Λ cdt2 Δ ncu05853 Δ crel为基础菌，继续改造(敲除或突变等)其它基因，得到的用于生产纤维素酶的工程菌。4.一种使微生物获得或提高生物质转化为化学品的方法，是利用权利要求1-3中所述组合突变体，获得或提高微生物将生物质降解后进一步将降解物(多种碳水化合物)转化为有机酸等化学品的方法。5.利用过量表达NCU05383等方法，抑制纤维二糖由微生物的胞外转运至胞内，从而使微生物可以利用生物质为原料，生产积累纤维二糖及其衍生化学品。6.根据权利要求1-5所述应用，其特征在于:所述微生物包括但不限于脉孢菌属(Neurospora)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、镰刀霉属(Fusarium)、腐质霉属(humicola)、孢壳霉属(Thielavia)、毁丝霉属(Mycel1phthora)或侧抱霉属(Sporotrichum)。
【专利摘要】本发明公开了高产纤维素酶和提升木质纤维素降解能力的基因工程菌及应用。本发明通过发现一个纤维寡糖转运蛋白类似蛋白CLP1(NCU05853)的功能,进一步组合敲除clp1和三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755，两个纤维寡糖转运蛋白基因NCU00801（cdt-1）和NCU08114（cdt-2），以及一个碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1（NCU08807）获得系列多基因突变菌株Δ3βGΔcdt2Δncu05853、Δ2βGΔcdt2Δncu05853、Δ3βGΔcdt2Δncu05853Δcre1和Δ2βGΔcdt2Δncu05853Δcre1，该组合突变菌株能够在纤维二糖或木质纤维素为底物时提升纤维素酶产量和木质纤维素降解能力。本发明提供了一种可以促进纤维素酶生产和以木质纤维素为原料生产化学品的方法。
【IPC分类】C12P19/12, C12N9/42, C12R1/645, C12R1/885, C12P19/14, C12R1/77, C12R1/66, C12R1/80, C12N1/14
【公开号】CN105647811
【申请号】
【发明人】田朝光, 蔡鹏丽, 王邦, 冀京枭, 姜永生, 孙文良, 万里, 马国力, 林良才, 尤伟, 马延和
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月10日