)首先分别在2% (2g/100mL)蔗糖培养基(配方:50X Vogel’s盐20mL，葡萄糖20g，定容体积到1L，高压灭菌。)上25°C培养48小时后，然后转入2%(2g/100mL)的微晶纤维素(AV)培养基25°C继续诱导培养7d，样品离心取上清液，测定蛋白浓度(Protein),跑 SDS-PAGE 和测定纤维素酶活(CMCase activity)。
[0059]2.2.1上清蛋白浓度测定
使用伯乐Bradford蛋白快速测试试剂盒检测I到7d上清中的蛋白浓度,结果如图3A所示。与野生型和Λ3β6相比，CPL7 ( A30GAcdt2AncuO5853)在第一天就有大量蛋白分泌。且蛋白浓度高于粗糙脉孢菌野生型菌株。
[0060]2.2.2 上清 SDS-PAGE 电泳检测
根据蛋白浓度，选择2d，3d和7d上清液进行4-12 % SDS-PAGE电泳检测，结果如图 4所示。上样顺序为 M:Maker，1: WT, 2: Δ 3 β G, 3: Δ3β GAcdtl (CPL2)，4: A3^GAcdt2 (CPL3)，5: Δ 3 β G Δ ncu05853 (CPL4)，6: Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2(CPL5), 7: Δ3β GAcdtl Ancu05853 (CPL6)，8: Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL7)，9:Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL8)。发现随着时间的延长,蛋白条带浓度逐渐加强，表明蛋白浓度逐渐增加。第二天泳道8的纤维素酶条带明显粗于其他菌株，表明纤维素酶高于其他菌株。泳道4中纤维素酶条带随着时间延长，条带逐渐加粗，表明纤维素酶逐渐提闻。
[0061]2.2.3上清纤维素酶酶活检测
选取Id, 3d, 5d和7d的上清进行纤维素酶酶活测定(CMCase activity),结果如图3B所示。微晶纤维素诱导条件下，CPL7 ( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)的纤维素酶酶活显著高于野生型菌株(WT)。
[0062]
实施例 3、多基因突变菌株 CPL2 ( Λ3β GAcdtl)，CPL3 ( A3^GAcdt2), CPL4(A3^GAncu05853), CPL5 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2), CPL6 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ ncu05853),CPL7 ( A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)的纤维二糖转运能力检测实验
将以上构建得到的多基因突变菌株CPL2 ( A3^GAcdtl),CPL3 ( Δ 3 β G Δ cdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2 Λ ncu05853)以及 Λ 3 β G 和野生型菌株FGSC2489(WT)首先分别在2 % (2g/100mL)蔗糖培养基(配方:50 X Vogel ’ s盐20mL，葡萄糖20g，定容体积到1L，高压灭菌。)上25°C培养48小时后，然后转入2% (2g/100mL)的纤维二糖(CB)培养基25°C继续培养7d，样品离心取上清液，测定上清中纤维二糖残留。
[0063]结果如图5A所示，与对照Λ3β6相比，CPL3( A3@GAcdt2)纤维二糖转运速率明显低于A30G，CPL7 ( A30GAcdt2AncuO5853)转运纤维二糖的速率明显加快，快于对照菌Λ 3 β G。表明CPL7 ( Δ 3 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)蛋白分泌和纤维素酶酶活提高是源于诱导物纤维二糖的转运速率提高，进入胞内起诱导作用的增强。结果显示通过敲除NCU05853可以提闻粗糖脉抱囷的纤维—糖转运速率，进而提闻纤维素酶的提闻，因此NCU05853对于粗糙脉孢菌纤维二糖的转运有抑制作用。由此可知，NCU05383也可以用于利用生物质积累(生产)纤维二糖的过程中。
[0064] 实施例4、多基因突变菌株CPL4 ( A3PGAncu05853) 和CPL7(Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853)的纤维二糖转运蛋白基因表达情况分析
将以上构建得到的多基因突变菌株CPL4 ( A3^GAncu05853), CPL5(Δ3β GAcdtl Acdt2)和 CPL7 ( Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853)以及 Δ3β6 首先分别在 2%(2g/100mL)鹿糖培养基(配方:50X Vogel’ s盐20mL,葡萄糖20g,定容体积到1L,高压灭菌。)上25°C培养16小时后，然后转入2% (2g/100mL)的纤维二糖(CB)培养基25°C继续培养4 h,菌丝抽滤,液氮速冻用于RNA的提取。使用Invitrogen公司Trizol试剂提取RNA, DNase I处理去除基因组DNA,使用b1-rad公司RNA反转录试剂盒iScript cDNA合成试剂盒进行RNA反转录为cDNA,反转录体系为:4 μ I 5X iScript react1n mix,I μ L iScript reverse transcriptase, 500 ng RNA,并用双蒸水补足至 20 yL,反应的程序为:25° C, 5 min ；42° C, 30 min ；85° C, 5 min。之后使用b1-rad公司的两步法qRT-PCR 试剂盒 IQ SYBR Green Supermix 在 Mastercycler? ep realplex (B1Rad)上进行纤维寡糖转运蛋白基因⑶T-1，⑶T-2和NCU5853基因的表达。qRT-PCR体系为:10 μ LIQTM SYBR? Green Supermix,0.5 μ L 10 μ M Forward primer,0.5 μ L 10 μ M Reverseprimer, I μ L cDNA,并用双蒸水补足至20 μ L ;扩增程序为:95°C预变性15 min后进入39个扩增循环(95 °C变性15 s，55°C退火30 s, 72 °C延伸30 S)，之后72°C延伸5 min ;融解曲线为:50°C -90°C，5s。检测引物对序列为:ActinRT-F:5，-TGATCTTACCGACTACCT-3’ 和ActinRT-R:5’-CAGAGCTTCTCCTTGATG-3 ；801RT-F:5’-CGAGACTGAGGAGATGAG-3’和 801RT-R:5’-GTATTGAAGTAACCGAGACC-3’ ； 8114RT-F:5’- CTTTATCTGGGTGTTCGG -3’和 8114RT-R:5’ - GTTCGCATAAGTATTGAGC -3’ ; 5853RT-F:5’ - GCCCTGACCTACACCTAC -3’ 和 5853RT-R:5’- GCCAAACGACCAAAGAGC -3’。qRT-PCR检测结果如图 5B 所示，CPL4( Λ 3 β G Λ ncu05853)和CPL7( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)突变体菌株的纤维寡糖转运蛋白基因表达显著增高，尤其是高产纤维素酶菌株CPL7 ( A3^GAcdt2Ancu05853)中纤维寡糖转运蛋白基因cdt-1的表达。
[0065]
实施例5、高产多基因突变菌株CPL7 ( A30GAcdt2AncuO5853)在纤维二糖条件下的转录组分析
将高产多基因突变菌株CPL7 ( Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)以及对照菌株CPL4(A33GAncu05853)和 Δ3β6 分别接种到 2%(2g/100mL)蔗糖培养基(配方:50X Vogel’s盐20mL，葡萄糖20g，定容体积到1L，高压灭菌。)上25 °C培养16小时后，然后转入2%(2g/100mL)的纤维二糖(CB)培养基25°C继续培养4 h，菌丝抽滤，液氮速冻用于RNA的提取。使用Invitrogen公司Trizol试剂提取RNA，DNase I处理去除基因组DNA。获得RNA进行转录组测序。
[0066]转录组测序在华大基因测序公司(深圳总部)Illumina HiSeqTM 2000的平台完成。在依据华大二代测序数据处理标准流程(WWW.genomics, cn)去接头和低质量数据过滤后，测序读段以最多2个错配的容忍性，用Tophat (版本2.0.Sb)软件比对到粗糙脉孢霉0R74A的基因组(第12版)上。比对结果储存在SAM文件中以供后续分析使用。运用HTSeq 统计唯一比对到转录本(第 7 版，www.broadinstitute.0rg/annotat1n/genome/neurospora/MultiHome.html)外显子区域的读段数,并基于此数值，通过基因长度和测序深度归一化处理，得到每个基因的表达值RPKM (每百万测序读段中某基因单位千碱基长度的读段数)。不同样本之间的基因差异分析使用GFOLD和DEGseq软件。定义GFOLD大于等于I (即归一化的表达差异大于等于2倍数)且DEGseq中费舍尔精确检验和似然比检验的P值小于10 4的两基因之间表达有显著差异。本研究中产生的所有转录组测序数据(包括Λ 3 β G，CPL4和CPL7菌株分别用2%纤维二糖诱导4小时)均以获取号GSE60004存储在NCBI 的 Gene Express1n Omnibus (GEO, www.ncb1.nlm.nih.gov/geo/)上。菌株 Δ3β6蔗糖诱导4小时的转录组数据来自GEO (获取号GSE36719)。
[0067]如图6Α所示，转录组数据分析显示，与对照菌株Λ3β6相比，CPL4和CPL7中上调等于和大于2倍的基因有1309个。与在2%纤维二糖条件下的纤维素酶生产保持一致，CPL7的基因表达谱显著不同于对照菌株Λ 3 β G和CPL4.聚类分析显示这1309个基因属于两个大的分类。
[0068]第一类(Cl)有804个基因，与对照菌株A3i3G相比，它们在CPL7中都有很高的表达，并且部分在CPL4中有高的表达。通过funcat分析，如图6B所示，在这804个基因中，225个基因富集在了碳复合物和碳水化合物代谢(多糖代谢相关)这个大的分类中。它包括主要的纤维素酶基因(NCU07340, NCU09680, NCU00762, NCU07190, NCU05121, NCU05057,和NCU04854)，主要的半纤维素酶基因和辅助功能基因(NCU08760, NCU02916, NCU02240,NCUO1050,和NCU00206)。如图6C所示，这些基因在CPL7中有很高的表达。如图6D所示，在这804个基因中，纤维素酶和半纤维素酶相关的转录因子(CLR-1，CLR-2和XLR-1)基因的表达上调了上百倍。除了这些基因之外，与前面的qRT-PCR分析结果一致的是纤维寡糖转运蛋白基因cdt-1 (NCU00801)也包括在这804个基因中，如图6E所示。与对照菌Δ3β6相比，cdt-1在CPL7中的表达上调了 86倍，NCU00809，一个同样也具有纤维寡糖转运能力的MFS转运蛋白的基因表达也明显上调。这些都支持了由于ncu05853的敲除，解除了 CPL7中的纤维二糖的转运抑制的观点。
第二大类有505个基因，这些基因在Λ3β G的蔗糖条件下有明显上调表达，部分在CPL7在纤维二糖条件下有上调表达。Funcat分析显示着505个基因的功能更多的是与生长相关，富集在蛋白合成，与蛋白结合和辅因子需求相关的结构，能量和代谢的几个分类中。
[0069]综上分析，通过转录组范围的基因表达谱分析，我们可以看到在CPL7突变体菌株中整个纤维素酶诱导和表达机制都被激