一种提高丝状真菌纤维素酶产量和木质纤维素降解利用的菌株构建方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，一种高效表达生产纤维素酶和提升木质纤维素降解能力的方法，主要涉及一个纤维寡糖转运类似蛋白CLPl (NCU05853)在粗糙脉孢菌纤维素酶诱导表达和它在纤维二糖转运中的作用的发现，以及NCU05853同一个纤维寡糖转运蛋白NCU008114和三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755的组合基因突变菌株的构建和纤维素酶产酶，以及利用NCU05853和纤维寡糖转运蛋白NCU08114同三个β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755及碳代谢阻遏蛋白CREl (NCU08807)的系列突变菌株作为基础菌株构建的其他菌株提升微生物产纤维素酶和木质纤维素降解能力。
【背景技术】
[0002]随着化石燃料，例如石油的不断挖掘，逐渐枯竭，以及对环境造成的污染等问题，寻找新的替代能源迫在眉睫，利用大量廉价的生物质(木质纤维素)作为原料发酵生产生物燃料一直是近年的研究热点。以木质纤维素为原料的生物炼制主要有三个步骤:预处理，酶解和糖利用。其中酶解是生物炼制过程中的一个重要的部分，也是需要解决的一个瓶颈问题。
[0003]木质纤维素的结构和成分复杂，其主要是由纤维素、半纤维素、果胶以及酚醛聚合物木质素所组成。纤维素主要是由D-葡萄糖单元通过β_1，4键连接成的线性多聚葡萄糖链。在结晶纤维素中，这些多聚链通过氢键包裹形成高度不溶的结构。半纤维素是自然界中仅次于纤维素的丰富的多聚物，其结构比纤维素更加复杂，由不同糖单元组成。木质纤维素的复杂成分及结构决定了其降解需要一系列的酶协同作用下来完成，其中纤维素完全降解为葡萄糖需要外切葡聚糖酶，也称为纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91 ;1，4-β -D-glucancellob1hydrolases),从多聚物的尾部水解出纤维二糖;内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4 ;1，4-β -D-glucan-4-glucanohydrolase),主要是从纤维素链的内部无定型区域酶切，为外切葡聚糖酶提供更多的作用位点。β -葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)将纤维二糖水解成葡萄糖。
[0004]自然界中很多微生物可以生产纤维素酶去降解木质纤维素，例如很多丝状真菌。但大多数野生型丝状真菌生产的纤维素酶对于木质纤维素的水解效率无法达到工业生产水平，因此这些真菌被改造，从而提高纤维素酶的产量以及水解效率。真菌菌种改造，一方面是传统诱变，工作量大，当菌种达到一定程度后，再使用传统诱变的方法进行改造，上升空间有限。另一方面是通过机理研究使用分子手段的理性改造。通过改造一个或多个基因来达到提高纤维素酶的目的。改造基因的选择是最终能否提高菌株纤维素酶的关键因素。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的是提供一种提高真菌产纤维素酶和提升纤维素降解利用的菌种改造方法，核心发明点是首次发现一个纤维寡糖转运蛋白类似蛋白CLP1(NCU05853)的功能是抑制纤维寡糖转运，通过组合改造(敲除、突变等)微生物的纤维寡糖转运类似蛋白CLPl和纤维寡糖转运蛋白以及β_葡萄糖苷酶基因和碳代谢阻遏基因CREl(NCU08807)，得到多个纤维素酶显著提升的组合突变体.尤其是5突变菌株(CPL7:Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853), 6 突变菌株(CPL9: Λ 3 β G Λ cdt2 Λ ncu05853 Λ crel)纤维素酶产酶和纤维素降解利用能力显著提升。本发明包括但不限于该5突变体和6突变体的系列组合突变可以用来发酵生产纤维素酶和利用纤维素生产生物基化学品。
[0006]第一方面，本发明提供用于生产纤维素酶的多基因突变菌株，能够在纤维二糖以及纤维素诱导条件下表达含纤维二糖水解酶CBHl和CBH2在内的纤维素酶系；为以下菌株之一:
a.命名为CPL7( A30GAcdt2AncuO5853)的基因突变菌株，是敲除纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β-葡萄糖苷酶基因NCU00130.NCU04952 和 NCU08755 的微生物菌株；
b.命名为CPL9( A30GAcdt2AncuO5853Acrel)，是敲除纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株；
c.命名为CPLlO( A2PGAcdt2Ancu05853)，是敲除纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)以及β -葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755的微生物菌株；
d.命名为CPLll( A20GAcdt2AncuO5853Acrel)，是敲除纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130和NCU08755以及碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的微生物菌株；
所述微生物为脉抱菌iNeurospora )、曲霉(Aspergillus )、木霉(Trichoderma )、青霉{Penicillium )、镰刀霉iFusarium)或侧孢霉iSporo trichum );优选为粗糙脉孢菌iNeurospora crassa)。
[0007]所述纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T_2 (NCU08114)以及葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸残基序列如下:
1)纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853的核苷酸序列如序列表中SEQID N0.1所示；纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.2所示；
2)纤维寡糖转运蛋白NCU08114的核苷酸序列如序列表中SEQID N0.3所示；纤维寡糖转运蛋白NCU08114编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.4所示；
3)β -葡萄糖苷酶基因NCU00130的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU00130编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.6所示；
4)β -葡萄糖苷酶基因NCU04952的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.7所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU04952编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.8所示；
5)β -葡萄糖苷酶基因NCU08755的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.9所示；β -葡萄糖苷酶基因NCU08755编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.10所示。
[0008]6)碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.11所示；碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)编码蛋白的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID N0.12所示。
[0009]构建上述多基因突变菌株的方法，包括敲除微生物中纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)中的不同组合；该过程可以通过不同单突变体的依次杂交来获得。
[0010]以上分别列出了本发明的技术方案。总体而言，本发明采用粗糙脉孢菌(又称脉孢霉)系统，该菌具有较为完善的遗传操作系统和大量的基因突变体库，功能基因组资源及其丰富，而且该菌有性杂交技术简单，便于操作，使得该菌非常易于进行分子改造，是纤维素酶研究的优秀体系。研究表明，本发明利用研究的非常透彻的模式真菌粗糙脉孢菌体系，其生长速度非常快，固体平板上，25度条件下，其菌丝24小时可以达到7厘米，显著快于其他丝状真菌如曲霉、木霉等，而且该菌遗传操作工具成熟，便于分子改造。本发明采用清晰的遗传操作等分子生物学技术，构建了一系列突变体工程菌株，可重复性高，技术路线清晰，并且能够在本发明基础上继续改造提升。本发明构建的菌株能够利用纤维二糖、纤维素等作为诱导物生产纤维素酶，比目前诱导物(槐糖等)生产成本低。本发明具有以下优点:
通过真菌杂交方法构建多个组合突变体(包括敲除纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114)和β -葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807)的不同组合所得菌株)的多基因突变体菌株，该系列多基因突变体菌株不仅能够以纤维二糖，还可以以纤维素为诱导物表达生产纤维素酶，提升木质纤维素降解能力(可用于提升以木质纤维素为底物生产化学品微生物构建)，降低纤维素酶成本和生物质为原料的化学品生产成本。
[0011]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0012]
【附图说明】
[0013]图1:多基因突变体在斜面上的生长
图2:多基因突变体在2%纤维二糖诱导条件下发酵上清中的蛋白分泌(A)和纤维素酶生产(B)
图3:多基因突变体在2%纤维素诱导条件下发酵上清中的蛋白分泌(A)和纤维素酶生产(B)
图4:多基因突变体在2%纤维二糖以及2%纤维素诱导条件下发酵上清的SDS-PAGE图图5:多基因突变体纤维二糖转运速率(A)和多基因突变体中纤维寡糖转运蛋白基因在2%纤维二糖诱导条件下的表达(B)
图6:高产纤维素酶多基因突变体菌株CPL7在纤维二糖条件下的转录组分析上调表达大于等于2倍的1309个基因的聚类图(Α)，804个基因的funcat分析图(B)，804个基因中的主要纤维素酶相关基因的表达水平图(C)，804个基因中的纤维素酶和半纤维素酶相关转录因子基因表达水平图(D)以及纤维寡糖转运蛋白基因表达水平图(E)
图7高产突变体CPL9 ( A3PGAcdt2Ancu05853Acrel)在纤维二糖诱导条件下的蛋白产量
图8高产突变体CPL9 ( A30GAcdt2AncuO5853Acrel)在纤维二糖诱导条件下的纤维素酶酶活(CMCase activity)。
[0014]图9高产突变体CPLlO ( A20GAcdt2AncuO5853)在纤维二糖和纤维素诱导条件下的蛋白产量。
[0015]图10高产突变体CPLlO ( A20GAcdt2AncuO5853)在纤维二糖诱导条件下的纤维素酶基因(NCU07340)和半纤维素酶相关转录因子(NCU06971)基因的表达水平
【具体实施方式】
[0016]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见:《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David I ,Molec μ Iar Cloning: A Laboratory Manual,3rd edit1n，2001，NY，Cold SpringHarbor)。
所出现的百分比浓度如无特别说明均为质量百分浓度。
[0017]实施例中描述到的的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
[0018]实施例中所采用的原始出发菌株和部分原始单基因敲除菌株均购买于美国真菌遗传资源中心(Fungal Genetics Stock Center,缩写FGSC)真菌菌种保存库,为商业渠道获得。各自FGSC编