号为:
纤维寡糖转运蛋白⑶T-1 (NCU00801)，FGSC 16575 (配型a);
纤维寡糖转运蛋白⑶T-2 (NCU08114),FGSC 17868 (配型a)和FGSC 17869 (配型A);纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853，FGSC 13770 (配型a)和FGSC 13771 (配型A);β-葡萄糖苷酶单基因突变菌株BGl (NCU00130), FGSC11822 (配型a)和FGSCl 1823(配型A)；
β -葡萄糖苷酶单基因突变菌株BG2(NCU04952)，FGSC13731(配型a)和FGSC13732 (配型A)；
β -葡萄糖苷酶单基因突变菌株BG3(NCU08755)，FGSC18387(配型a)和FGSC18388(配型A)；
碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1 (NCU08807),FGSC 18633 (配型a);
野生型粗糙脉胞菌WT，FGSC 2489 ；
“NCU……”为粗糙脉孢菌的基因位点编号，“FGSC……”为FGSC的保藏编号。
[0019]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0020]
实施例1、构建用于生产纤维素酶的多基因突变菌株Δ3β G(Δ ncu00130 Δ ncu04952 Δ ncu08755), CPL2 ( Δ3β GΔcdtl),CPL3 ( Δ3β GΔcdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Δ3β GAcdtlA cdt2)，CPL6 ( Δ3β GAcdtlA ncu05853), CPL7(Λ 3 β G Λ cdt2 Δ ncu05853)和 CPL8 ( Δ3β GAcdtlA cdt2 Δ ncu05853)
构建方法包括以下步骤:
IA2PG ( Ancu00130Ancu08755)的构建 1.1杂交 I)作为父本的β-葡萄糖苷酶单突变体菌株BGl (NCU00130)，FGSC11822 (配型a)在MM斜面培养基【50 X Vogel’ s盐20mL,鹿糖20g,琼脂15g,组氨酸(50mg/mL) 20mL,定容体积到1L，高压灭菌。50 X Voger s盐(1L):柠檬酸三钠(1/2H20) 150g，无水KH2PO4 250g，无水 NH4NO3 10g, MgSO4*7H20 10g, CaCl2CH2O 5g，微量元素盐溶液 5mL，生物素(0.lmg/mL)2.5mL,定容体积到1L。】上28°C培养7天后待用。
[0021]2)作为母本的β -葡萄糖苷酶单突变体菌株BG3 (NCU08755), FGSC18388(配型A)在Westergaards平板培养基【4 X Westergaards盐溶液250mL,鹿糖15g,琼脂15g,调PH值 6.5,定容到 1L,高压灭菌，倒平板。4XWestergaards 盐溶液(1L):KN03 4g, KH2PO4 4g,MgSO4*7H20 2g，微量元素盐溶液4mL，生物素(0.lmg/mL) 200 μ L，定容体积到1L。】上28°C培养10天，在体式显微镜下观察子囊，若有子囊产生，则进行杂交试验，若未产生子囊则继续培养，直至看到大量子囊产生为止。
[0022]3)取ImL无菌水洗在MM斜面培养基上培养的BGl (NCUOO130)菌株孢子，制成孢子悬液，浓度为I X 17,均匀滴到Westergaards平板培养基上，用无菌枪头均匀涂布，尽量涂成规则形状，以便观察是否污染。
[0023]3)杂交后的平板28°C培养大约2周后，在体式显微镜下观察培养皿上盖上是否有子囊孢子，若发现喷发出的子囊孢子，则取ImL无菌水冲洗培养皿上盖，收集子囊孢子，4°C或常温保存。
[0024]4)取收集的子囊孢子3 μ L加入30 μ L无菌水放于60°C水浴热激半小时，杀死子囊孢子里混合的红色分生孢子。
[0025]5)采用玻璃珠子法涂BDES (杂交筛选培养基)+hph (潮霉素)平板【配方:BDES平板培养基(IL):50XVogel’ s盐20mL,琼脂15g，定容到950mL,高压灭菌，再加50mL20 XBDES盐溶液，倒平板(潮霉素hph终浓度200 μ g/mL)】，28°C培养12小时后在显微镜下挑单菌落(挑单菌落过程中，挑取发生菌丝交叉的单菌落)，转接到MM+hph斜面培养基【配方:50XVogel’ s盐20mL,鹿糖20g,琼脂15g,组氨酸(50mg/mL) 20mL,定容体积到1L,高压灭菌。50 X Vogel’ s 盐(IL):柠檬酸三钠(1/2H20) 150g，无水 KH2PO4 250g，无水 NH4NO3100g,MgSO4*7H20 10g，CaCl2CH2O 5g，微量元素盐溶液 5mL，生物素(0.lmg/mL) 2.5mL，定容体积到1L。】中28°C培养3天。
[0026]6) 3天后，将挑取的菌转接到丽斜面培养基上28°C培养3天，然后放于室温下培养7天，提孢子DNA进行PCR验证。
[0027]1.2提基因组DNA
采用酚氯仿法从BGl (NCU00130)&BG3 (NCU08755)杂交菌产生的孢子中提取基因组DNA,具体包括以下操作:
1)2.0mL的无菌的DNA提取管中加入200mg的锆珠，标号准备下一步用.2)加ImL 的裂解液(lysis buffer，配方:0.2M Tris.HCl (pH 7.5)，0.5Μ NaCl, 1mMEDTA，I % SDS (w/v))于每个斜面培养基试管中，用ImL枪头将孢子轻轻刮下，将孢子溶解。
[0028]3)漩涡震荡10s，取400 μ L孢子悬液预先准备好的DNA提取管中。
[0029]4)将所有DNA提取管置于助磨器上，最大转速振荡30s，重复两次。
[0030]5) 65°C水浴30分，在水浴过程中每个几分钟取出漩涡振荡。
[0031]6)水浴结束后取出，每管加入80 μ L pH 7.5的IM的Tris-HCl中和。
[0032]7)加入400 μ L的酚:氯仿(1:1)，13000rpm离心5分钟。
[0033]8)取300 μ L上清液于新的1.5mL EP管中，加入600 μ L 95%的乙醇(DNA级)。
[0034]9)冰上孵育一小时，随后4°C、13000rpm离心，可看到白色的DNA沉淀到EP管底部。
[0035]10)用75%的酒精(DNA级)400 μ L清洗，4度13000rpm离心，轻轻取出上清液。
[0036]11)将EP管置于真空浓缩仪中，真空干燥酒精。
[0037]12)加入50 μ L ddH20溶解DNA，用NanoDrop测DNA浓度，测完浓度后将提取的DNA置于-20°C冰箱保存，以备下一步进行PCR验证。
[0038]1.3 PCR验证突变体
BGl (NCU00130)&BG3 (NCU08755)杂交菌中提取基因组DNA (方法见1.2)，以提取的基因组DNA为模版进行基因BGl (NCUOO130) &BG3 (NCU08755)的PCR验证。
[0039]I) 25 μ L RCR体系包括:12.5 μ L DreamTaq PCR Master Mix 12.5 μ L, 9.5 μ L 水(nuclease-free),上、下游引物各IyL (上游引物序列hph5f,为了验证潮霉素hph基因，序列为5’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3’，下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCUOO130 基因位点，序列为 5，-GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’和下游引物 NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU08755基因位点，序列为5’- GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’)，基因组 DNA IuL0
[0040]2) PCR扩增条件为:先95°C预变性5分钟；然后94°C变性30秒，52°C退火45秒，72°C延伸2分钟，共34个循环；最后72°C退火10分钟。
[0041]3)对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(IlOV电压，30分钟)，在凝胶成像系统下看基因扩增条带，显示在上游弓I物hph5f和下游引物NCUOO130r的引导下经PCR扩增获得了 1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了 1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，只要两个条带同时电泳可见，则表明两基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1和N0.5所示)敲除成功，。该结果确证已获得了 β -葡萄糖苷酶双基因突变菌株，命名为Δ2β6 ( Ancu00130Ancu08755)(配型a)。
[0042]
2Δ3β6 ( Λ IicuOOl3OAncuO4952 AncuO8755)的构建
2.1 杂交:以实施例1中Λ2β6 (Ancu00130Ancu08755)(配型a)作为母本，以BG2 (NCU04952), FGSC13732 (配型A)作为父本进行杂交，方法见实施例1步骤1.1。
[0043]2.2提基因组DNA:方法见实施例1步骤1.2。
[0044]2.3 PCR验证筛选突变体
上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU 00130基因位点，序列为5’ -GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3’ ；下游引物 NCU04952r，为了 验证潮霉素 hph 基因处在 NCU04952基因位点，序列为5’ -AACACACACACACACACTGG-3’ ；下游引物NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU 08755基因位点，序列为5’ -GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’。PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤I。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引导下经PCR扩增获得了 1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引导下经PCR扩增获得了 1910bp目的条带，该条带表明NCU04952基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了 1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要三个条带同时电泳可见，则表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，与预期结果相符，表明获得了 β -葡萄糖苷酶三基因突变菌株，命名为 Δ3β6 ( Δ ncu00130 Δ ncu04952 Δ ncu08755)(配型 a)。
[0045]
3Δ cdtl Δ cdt2 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114)的构建
3.1 杂交:以 Acdtl (NCU00801, FGSC 16575 配型 a)作为母本，以 Λ cdt2(NCU08114),FGSC 17869 (配型A)作为父本进行杂交，方法见实施例1步骤1.1。
[0046]3.2提基因组DNA:方法见实施例1步骤1.2。
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