0047]3.3 PCR验证筛选突变体
上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物801Vr,为了验证潮霉素hph基因处在NCU00801基因位点，序列为5’ -TTAGGGTTGTAGACACCTGC-3’ ；下游引物 8114Vr，为了验证潮霉素 hph 基因处在 NCU08114基因位点，序列为5’ - GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤I。结果在上游引物hph5f和下游引物801Vr的引导下经PCR扩增获得了 1741bp目的条带，该条带表明NCU00801基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引导下经PCR扩增获得了 1857bp目的条带，该条带表明NCU08114基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要三个条带同时电泳可见，则表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，与预期结果相符，表明获得了 β -葡萄糖苷酶三基因突变菌株，命名为 Δ cdtl Δ cdt2 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114)(配型 a)。
[0048]
4Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114 Δ ncu05853)的构建
4.1 杂交:以 3 中获得的 AcdtlAcdt2 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114)(配型 a)作为母本，以Ancu05853 (NCU05853)，FGSC 13771 (配型A)作为父本进行杂交，方法见实施例1步骤1.1。
[0049]4.2提基因组DNA:方法见实施例1步骤1.2。
[0050]4.3 PCR验证筛选突变体
上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物801Vr,为了验证潮霉素hph基因处在NCU00801基因位点，序列为5’ -TTAGGGTTGTAGACACCTGC-3’ ；下游引物 8114Vr，为了验证潮霉素 hph 基因处在 NCU08114基因位点，序列为5’ - GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；下游引物5853Vr，为了验证潮霉素hph基因处在NCU05853基因位点，序列为5’ -GAGCAAGGTTATAGGACTGC-3’ ；PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤I。结果在上游引物hph5f和下游引物801Vr的引导下经PCR扩增获得了 1741bp目的条带，该条带表明NCU00801基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引导下经PCR扩增获得了 1857bp目的条带，该条带表明NCU08114基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物5853Vr的引导下经PCR扩增获得了 1677bp目的条带，该条带表明NCU05853基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要三个条带同时电泳可见，则表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，与预期结果相符，表明获得了 β -葡萄糖苷酶三基因突变菌株，命名为 Acdtl Acdt2Ancu05853 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114 Δ ncu05853)(配型 A)。
[0051]
5 CPL2 ( Δ 3 β GA cdtl), CPL3 ( A3^GAcdt2), CPL4 ( Δ 3 β G Δ ncu05853 ),CPL5 ( A3^GAcdtlAcdt2), CPL6 (A3^GAcdtlAncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)的构建
5.1 杂交:以 2 中获得的 Λ3β6 ( Δ ncu00130 Δ ncu04952 Δ ncu08755)(配型 a)作为母本，以 4 中获得的 Acdtl Acdt2Ancu05853 ( Δ ncu00801 Δ ncu08114 Δ ncu05853)(配型A)作为父本进行杂交，方法见实施例1步骤1.1。
[0052]5.2提基因组DNA:方法见实施例1步骤1.2。
[0053]5.3 PCR验证筛选突变体
上游引物hph5f，为了验证潮霉素hph基因，序列为5 ’ -TGCAATAGGTCAGGCTCT-3 ’ ；下游引物NCU00130r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU 00130基因位点，序列为5 ’ -GTAGTGTACAAACCCCAAGC-3，.’下游引物NCU04952r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU04952 基因位点，序列为 5’-AACACACACACACACACTGG-3’ ；下游引物 NCU08755r，为了验证潮霉素hph基因处在NCU 08755基因位点，序列为5’ -GACAGTGGAGGTGAGAAAGG-3’ ；下游引物801Vr,为了验证潮霉素hph基因处在NCU00801基因位点，序列为5’ -TTAGGGTTGTAGACACCTGC-3’ ；下游引物 8114Vr，为了验证潮霉素 hph 基因处在 NCU08114基因位点，序列为5’ - GACGACCAGAACTAGGTAGG-3’ ；下游引物5853Vr，为了验证潮霉素hph基因处在NCU05853基因位点，序列为5’ -GAGCAAGGTTATAGGACTGC-3’。PCR反应体系及反应条件见实施例1步骤I。结果在上游引物hph5f和下游引物NCU00130r的引导下经PCR扩增获得了 1780bp目的条带，该条带表明NCU00130基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU04952r的引导下经PCR扩增获得了 1910bp目的条带，该条带表明NCU04952基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物NCU08755r的引导下经PCR扩增获得了 1850bp目的条带，该条带表明NCU08755基因已经被潮霉素hph基因替代。结果在上游引物hph5f和下游引物SOlVr的引导下经PCR扩增获得了 1741bp目的条带，该条带表明NCU00801基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物8114Vr的引导下经PCR扩增获得了 1857bp目的条带，该条带表明NCU08114基因已经被潮霉素hph基因替代；在上游引物hph5f和下游引物5853Vr的引导下经PCR扩增获得了 1677bp目的条带，该条带表明NCU05853基因已经被潮霉素hph基因替代。通过PCR方法扩增出同源重组的hph基因片段即表明已经成功敲除目的基因，所以只要六个条带同时电泳可见，则表明三基因(核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1、N0.3、N0.5所示)敲除成功，与预期结果相符，表明获得了 CPL2 (Λ3β GAcdtl )，CPL3 ( Λ 3 β G Λ cdt2)，CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2 Λ ncu05853)。多基因突变体见图1所示。
[0054]实施例2、多基因突变菌株 CPL2 ( Λ 3 β GΛ cdtl)，CPL3 ( Λ 3 β GΛ cdt2)，CPL4(A3^GAncu05853), CPL5 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2), CPL6 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ ncu05853),CPL7 ( A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)的纤维素产酶功能验证实验
2.1纤维二糖(Cellob1se)诱导产纤维素酶实验
将以上构建得到的多基因突变菌株CPL2 ( A3^GAcdtl),CPL3 ( Δ 3 β G Δ cdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A3PGAcdt2Ancu05853)和 CPL8( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2 Λ ncu05853)以及 Λ 3 β G 和野生型菌株FGSC2489(WT)首先分别在2 % (2g/100mL)蔗糖培养基(配方:50 X Vogel ’ s盐20mL，葡萄糖20g，定容体积到1L，高压灭菌。)上25°C培养48小时后，然后转入2% (2g/100mL)的纤维二糖(CB)培养基25°C继续培养7d,样品离心取上清液，测定蛋白浓度(Protein)，跑SDS-PAGE 和测定纤维素酶活(CMCase activity)。
[0055]2.1.1上清蛋白浓度测定
使用伯乐Bradford蛋白快速测试试剂盒检测I到7d上清中的蛋白浓度,结果如图2A所示。与野生型和Δ3β6相比，CPL2，CPL3，CPL6和CPL7的蛋白都有提高，其中CPL3和CPL7的蛋白浓度提高最为明显，CPL3蛋白提高较缓，CPL7 ( Λ 3 β G Λ cdt2 Λ ncu05853)迅速提高蛋白浓度，在第一天就有大量蛋白分泌。
[0056]2.1.2 上清 SDS-PAGE 电泳检测
根据蛋白浓度，选择2d，3d和7d上清液进行4-12 % SDS-PAGE电泳检测，结果如图 4所示。上样顺序为 M:Maker，1: WT, 2: Δ 3 β G, 3: Δ3β GAcdtl (CPL2)，4: A3^GAcdt2 (CPL3)，5: Δ 3 β G Δ ncu05853 (CPL4)，6: Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2(CPL5), 7: A3^GAcdtl Ancu05853 (CPL6)，8: Δ 3 β G Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL7)，9:Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853 (CPL8)。发现随着时间的延长,蛋白条带浓度逐渐加强，表明蛋白浓度逐渐增加。第二天泳道8的纤维素酶条带明显粗于其他菌株，表明纤维素酶高于其他菌株。泳道4中纤维素酶条带随着时间延长，条带逐渐加粗，表明纤维素酶逐渐提闻。
[0057]2.1.3上清纤维素酶酶活检测
选取Id, 3d, 5d和7d的上清进行纤维素酶酶活测定(CMCase activity),结果如图2B所示。纤维二糖诱导条件下，野生型粗糙脉孢菌(WT)尽管有蛋白分泌但无纤维素酶酶活。与Λ 3 β G相比，CPL3和CPL7都有很高的纤维素酶酶活。与SDS-PAGE检测一致，CPL3随着时间延长，酶活逐渐提高，CPL7则是在纤维二糖诱导第一天就有大量的纤维素酶酶活。
[0058]
2.2微晶纤维素(Avicel)诱导产纤维素酶实验
将以上构建得到的多基因突变菌株CPL2 ( A3^GAcdtl),CPL3 ( Δ 3 β G Δ cdt2), CPL4(Λ 3 β G Λ ncu05853)，CPL5 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ cdt2)，CPL6 ( Λ 3 β G Λ cdtl Λ ncu05853), CPL7(A33GAcdt2Ancu05853)和 CPL8 ( Δ 3 β G Δ cdtl Δ cdt2 Δ ncu05853)以及 Λ 3 β G 和野生型菌株FGSC2489 (WT