图19。
[0205]5.3.实验例 3
[0206]实验例3中，在上述的核酸提取用试剂盒2000中的、管200的内部使用具有第一液柱10?第五液柱50的结构。
[0207]吸附液的组成以及磁性珠分散液与实验例I相同，第一、三、五液柱也与实验例I同样为娃油。
[0208]第二液柱的第一清洗液为ρΗ8.0的Tris-盐酸缓冲液(溶质浓度5mM)。而且，第四液柱的溶出液为灭菌水。
[0209]使用移液管从容器口加入50 μ L从人体采集的血液，对容器装上盖利用手振摇30秒钟进行搅拌。然后，取下容器的盖与管连接。此外，在管的两端存在栓，从而取下第一液柱侧的栓将容器与管连接。
[0210]然后，利用手使永久磁铁移动，而将容器内的磁性珠导入管内。然后，使磁性珠移动至第四液柱。磁性珠存在于管内的各液柱的时间大致如下。第一、三液柱:各3秒，第二液柱:20秒，第四液柱:30秒。此外，在第二液柱中，不进行使磁性珠振动等的操作。另外，第二液柱以及第四液柱的体积分别为25 μ L以及I μ L。
[0211]接下来，取下管的第五液柱侧的栓，利用手使容器变形，从而将第五液柱以及第四液柱排出至PCR的反应容器。该操作在通过永久磁铁使磁性珠移动而使其退避至第二液柱后进行。
[0212]然后，向该提取液加入19 μ L的PCR的反应试剂，根据常规方法进行实时PCR。PCR的反应试剂的详细内容如下:LightCycler480Genotyping Master (Roche-Diagnostics 公司制 4 707 524)4 μ L、用灭菌水稀释了 1000 倍的 SYBR Green I (Life Technologies 公司$ij S7563)0.4μ?,100μΜ^ β 肌动蛋白检测用引物(F/R)各 0.06 μ L、灭菌水 14.48 μ L。
[0213]此时的扩增曲线是与图19几乎相同的特性。此外，在该实验例中，在使第二液柱的第一清洗液为76质量％的盐酸胍进行同样的实验的情况下，根据实验例I的扩增曲线看出10循环以上的上升迟缓。
[0214]5.4.实验例 4
[0215]溶出温度相对于DNA收量的影响
[0216]在实验例4中，通过通常的核酸提取法进行核酸的提取。
[0217]首先，在容量1.5mL的聚乙烯制容器中收容375 μ L的吸附液以及20 μ L的磁性珠分散液。作为吸附液、磁性珠分散液的组成，与实验例I相同。
[0218]接下来，使用移液管从容器口导入50 μ L浓度调配成Ing/μ L的基因组DNA溶液，对容器装上盖，通过旋涡混合器搅拌10分钟，对磁性架以及移液管进行操作而进行B/F分离操作。该状态下，在容器内残留有磁性珠以及少量的吸附液。
[0219]接下来，向容器中导入450 μ L与实验例I相同组成的第一清洗液，装上盖通过旋涡混合器搅拌5秒钟，对磁性架以及移液管进行操作除去第一清洗液。重复两次该操作。该状态下，在容器内残留有磁性珠以及少量的第一清洗液。
[0220]接下来，向容器导入450 μ L与实验例I相同组成的第二清洗液，装上盖通过旋涡混合器搅拌5秒钟，对磁性架以及移液管进行操作除去第二清洗液。该重复两次操作。该状态下，在容器内残留有磁性珠以及少量的第二清洗液。
[0221]然后，将灭菌水(溶出液)50 μ L加入容器，装上盖通过旋涡混合器搅拌5秒钟后，通过管式加热器加热2分钟。然后，再次通过旋涡混合器搅拌10秒钟，对磁性架以及移液管进行操作回收上清液。此时使管式加热器的加热温度为23°C (放置室温)、45°C、65°C这三个温度进行。
[0222]然后，从该提取液分注出I μ L，再加入19 μ L的PCR的反应试剂，根据常规方法进行实时PCR。此时，作为比较样品，将浓度调配成Ing/ μ L的基因组DNA溶液也追加到PCR反应样品。PCR的反应试剂的详细内容如下:LightCycler480GenotypingMaster (Roche-Diagnostics 公司制 4 707 524) 4 μ L、用灭菌水稀释了 1000 倍的 SYBR Green I (LifeTechnologies公司制S7563)0.4 μ L、100yM的β肌动蛋白检测用引物(F/R)各0.06 μ L、灭菌水14.48 μ L0
[0223]将此时的溶出温度与DNA收量的关系示于图20。其结果由实时PCR的上升循环通过计算求出。若将比较样品的上升循环设为CtO、将提取样品的上升循环设为Ctl，则DNA收量是比较样品(成为I)的比，由式“2(et°etl)”表示。
[0224]5.5.实验例 5
[0225]在实施例5中，对从核酸提取设备的液柱至戴上作为带电物质的丁晴手套的手的距离的、液柱的错位、分裂的效果进行了调查。
[0226]首先，准备了十根内径Imm外径3mm的聚丙烯管。相对于各管填充了动粘度2cSt (25°C )的硅油与I μ L的纯水。然后，利用戴上丁晴手套的手握住各管的填充了硅油以及水的部分，使该手上下往复移动十次。然后，对水的液面的位置偏移Imm以上的管数以及水分裂的管数进行了计数。其结果，在十根管全部中，产生了液面的错位或者液柱的分裂。
[0227]接下来，分别准备了十根内径3mm外径5mm的聚丙稀管以及内径Imm外径3mm的聚丙稀管。而且，将内径Imm外径3mm的聚丙稀管插入内径3mm外径5mm的聚丙稀管的各自的内腔，而形成十根内径1mm、外径5mm的管。
[0228]相对于各管填充了动粘度2cSt(25°C )的硅油与I yL的纯水。然后，利用戴上丁晴手套的手握住各管的填充了硅油以及水的部分，使该手上下往复移动十次。然后，对水的液面的位置偏移1_以上的管数以及水分裂的管数进行了计数。其结果，在十根管中的、九根产生了液面的错位或者液柱的分裂。
[0229]接下来，分别准备了十根内径5mm外径7mm的聚丙稀管、内径3mm外径5mm的聚丙稀管、以及内径Imm外径3mm的聚丙稀管。然后，将内径3mm外径5mm的聚丙稀管插入内径5mm外径7mm的聚丙稀管的各自的内腔，将内径Imm外径3mm的聚丙稀管分别插入该内径3mm外径5mm的聚丙稀管的各自的内腔，从而形成十根内径1mm、外径7mm的管。
[0230]相对于各管填充了动粘度2cSt(25°C )的硅油与I yL的纯水。然后，利用戴上丁晴手套的手握住各管的填充了硅油以及水的部分，使该手上下往复移动十次。然后，对水的液面的位置偏移1_以上的管数以及水分裂的管数进行了计数。其结果，在十根管中均未产生液面的错位或者液柱的分裂。
[0231]5.6.实验结果
[0232]由上述实验例判明以下结果。
[0233](I)若对作为PCR的前处理的核酸的提取处理所需的时间进行比较，则从将检体插入容器至向PCR的反应容器导入靶核酸的时间在实验例I中约为2分钟。在实验例2中约为30分钟。由此可知实验例I的核酸提取方法与实验例2的核酸提取方法相比，核酸提取所需的时间大幅减少。
[0234](2)另外，各清洗液在实验例I中是实验例2的约18分之I的量。并且，溶出液的量在实验例I中也是实验例2的约50分之I。因此，判明了在实验例I中，清洗液与溶出液的量相对于实验例2非常少且充分。
[0235](3)此外，若在吸附液以及溶出液的量中对溶出液中的靶核酸的浓度进行比较，则考虑为理想的是实验例I成为实验例2的50倍的浓度。但是，在这次的实验例中，血液样品所含的核酸量多，超过了 I yL的磁性珠的可吸附量，无法全量回收血液样品所含的核酸，因此实验例I无法获得实验例2的50倍浓度。在为核酸含量不超过至少I μ L的磁性珠的可吸附量的检体的情况下，在实验例I中能够获得实验例2的50倍浓度。
[0236](4)而且，若观察图19的图，则判明了即便在核酸的含量较多的全血样品中，核酸的扩增率的上升在实验例I中比实验例2早约0.6个循环。S卩，判明了在实验例I中使用的PCR的反应液与在实验例2中使用的PCR的反应液相比，靶核酸的浓度较高。由此证实了溶出液中的靶核酸的浓度在实验例I中比实验例2高。
[0237](5)由实验例3的结果判明了第二液柱即便为缓冲液也能够充分地提取。另外，判明了在第二液柱为胍水溶液的情况下，因酶反应阻碍的影响而使PCR扩增曲线的上升大幅迟缓。另外，判明了通过将提取液稀释到至少1000倍以上，能够将胍水溶液的酶反应阻碍的影响抑制较小。
[0238](6)由实验例4的结果判明了只要使第四液柱高于40°C左右，则在DNA的收量利用于PCR的情况下变得充分。
[0239](7)由实验例5的结果判明了从填充有试剂的液体部分，即液柱部分使带电物质分离3mm以上，从而能够抑制液面的错误或者液柱的分裂。
[0240]本发明不限于上述的实施方式，能够进一步进行各种变形。例如，本发明包括与在实施方式中进行了说明的结构实质上相同的结构(例如，功能、方法以及结果相同的结构或目的以及效果相同的结构)。另外，本发明包括将在实施方式中进行了说明的结构的非本质部分置换而得的结构。另外，本发明包括与在实施方式中进行了说明的结构起到相同的作用效果的结构或能够实现相同的目的的结构。另外，本发明包括向在实施方式中进行了说明的结构添加公知技术的结构。
[0241]符号说明
[0242]10…第一液柱;20…第二液柱;30…第三液柱;40…第四液柱;50…第五液柱；60…第六液柱；70…第七液柱；100…管部；110…栓；120…容器；121…开口 ；122…盖；130…储液部；131…开口 ；132…盖；140…帽；150…伸缩式帽；151…盖；160…盖；161…弹簧；170…支承部；171…罩部；173…狭缝；174…盖；175…盖；180…紧固件；181…袋；200…管；300…安装部；310…支板；320…夹子机构；330…较链；340…导轨；350…驱动带；360…移动机构;400…磁力施加部;410…永久磁铁；420…马达；500…移动机构;600…加热部;610…加热器;1000、1020、1030、1040、1100…核酸提取用设备;2000…核酸提取用试剂盒；3000、3100…核酸提取用装置;M…磁性粒子。
【主权项】
1.一种核酸提取用设备，其特征在于， 具有管部以及配置于所述管部的周围的罩部， 所述管部在内部依次配置有第一液柱?第五液柱，其中， 所述第一液柱由油构成； 所述第二液柱由对吸附有核酸的物质进行清洗的、不与油混和的清洗液构成； 所述第三液柱由油构成； 所述第四液柱由使核酸从所述物质溶出的、不与油混和的溶出液构成； 所述第五液柱由油构成。2.—种核酸提取用设备，其特征在于，具有: 管部以及配置于所述管部的周围的罩部， 所述管部在内部配置有由油构成的第一液柱、以及由不与油混和的水系溶液构成的第二液柱。3.根据权利要求1或2所述的核酸提取用设备，其特征在于， 所述罩部能够装卸。4.根据权利要求1或2所述的核酸提取用设备，其特征在于， 所述罩部能够沿所述管部延伸的方向伸缩。5.根据权利要求1或2所述的核酸提取用设备，其特征在于， 所述管部与所述罩部分离。6.根据权利要求1?5中任一项所述的核酸提取用设备，其特征在于， 从所述管部的内腔表面至所述罩部的外表面的距离为3mm以上。7.根据权利要求1、2、5或6中任一项所述的核酸提取用设备，其特征在于， 所述罩部设置有沿所述管部延伸的方向延伸的狭缝。8.根据权利要求1、2、5或7中任一项所述的核酸提取用设备，其特征在于， 在所述罩部设置有孔。9.根据权利要求1或2所述的核酸提取用设备，其特征在于， 所述罩部由能够变形的材料形成， 在所述管部与所述罩部之间封入有气体从而防止所述管部与所述罩部附着。10.根据权利要求1?9中任一项所述的核酸提取用设备，其特征在于， 在所述罩部含有从金属或者合金中选择的非磁性物质。11.一种核酸提取用设备，其特征在于， 具有管部，并且所述管部的侧壁的厚度为3mm以上， 在所述管部的内部依次配置有第一液柱?第五液柱，其中， 所述第一液柱由油构成； 所述第二液柱由对吸附有核酸的物质进行清洗的、不与油混和的清洗液构成； 所述第三液柱由油构成； 所述第四液柱由使核酸从所述物质溶出的、不与油混和的溶出液构成； 所述第五液柱由油构成。12.根据权利要求1?10中任一项所述的核酸提取用设备，其特征在于， 在所述管部的侧壁含有从金属或者合金中选择的非磁性物质。
【专利摘要】本发明提供一种能够缩短用于PCR的前处理所需的时间的核酸提取用设备。本发明所涉及的核酸提取用设备具有：管部以及配置于上述管部的周围的罩部，其中，上述管部在内部依次配置有由油构成的第一液柱、对吸附有核酸的物质进行清洗的、由不与油混和的清洗液构成的第二液柱、由油构成的第三液柱、从上述物质溶出核酸的、由不与油混和的溶液构成的第四液柱以及由油构成的第五液柱。
【IPC分类】C12M1/00
【公开号】CN105647779
【申请号】
【发明人】花村雅人, 井手上公太郎, 齐藤祐司, 山田圣人
【申请人】精工爱普生株式会社
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2015年11月25日