（-219至-140bp) 确实赋予了 mini35S启动子明显的高盐和PEG胁迫响应特性，极有可能含有盐/干旱胁迫 相关的顺式作用元件。
[0114] 实施例8 :D8启动子转化玉米评估其在玉米抗逆遗传改良中的应用价值
[0115] 1)选取玉米齐319自交系进行农杆菌介导的遗传转化。种子灭菌后萌发，其茎尖 离体培养产生丛生芽，最终以丛生芽作为受体进行转化。培养基如下：
[0116] 种子萌发培养基：KN031900mg/l，KI 0· 83mg/l，CaCl2 · 2H20 440mg/l， KH2PO4 · H20170mg/1，MnSO4 · 4H20 22. 3mg/l，H3B0310mg/l，MgSO4 · 7H20 370mg/l， FeSO4 · 7H2027. 8mg/l，NH4N0316 50mg/l，CuSO4 · 5H20 0· 025mg/l，CoCl2 · 6H20 0· 025mg/l， Na2MoO4 · 2H20 0· 5mg/l，ZnSO4 · 7H20 10mg/l，盐酸吡哆醇 1.0 mg/1，盐酸硫胺素 10.0 mg/1， 甘氨酸2. Omg/1，烟酸1.0 mg/1，酪蛋白水解物500mg/l,鹿糖30g/l,肌醇100.0 mg/1，生物 素0. 05mg/l，琼脂粉7g/l，pH 5. 8-6. 0,用于种子萌发（液体培养基中不加琼脂）。
[0117] 4培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加6-84 4.5-9.0以111〇1/1和2,4一0 1. 〇-3. Omol/1 〇
[0118] B培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加 IBA (吲哚丁酸）1. 8 μπιο?/?和6-BA 4. 5mol/l 〇
[0119] 成苗培养基：在上述种子萌发培养基的基础上加 IBA 3. 6μπιο1/1和6-BA 2. 25 μ mol/1 〇
[0120] 生根培养基：在上述种子萌发培养基的基础上添加 IBA 2. 8-3. 6 μ mol/1。
[0121] 培养基经高温高压灭菌，抗生素及除草剂等活性成分应经高压过滤灭菌。
[0122] 2)种子的灭菌与萌发：将玉米种子用70 %乙醇灭菌8min，0. 1 %氯化汞溶液灭菌 lOmin，最后用无菌水洗涤5-7遍。将灭菌后的种子置于培养瓶中（培养瓶封口且瓶内放少 量无菌水），于28°C黑暗处萌发2天。当种子露白后，将其转移到基本培养基中继续培养 (28°C，黑暗）。
[0123] 3)茎尖的离体培养：当萌发种子的胚芽长到3-5厘米左右时，将胚芽鞘和幼叶进 行剥离，最后将5毫米左右的上胚轴和茎尖切取并接种在A培养基中26°C暗培养（在此过 程中要注意及时切除伸长的下胚轴和幼叶）。
[0124] 4)丛生芽组织的诱导、继代与分化：离体茎尖在培养7-10天左右后开始发生不规 则的膨大，在膨大的分生组织处有瘤状和指状的突起。20天后，在突起的表面开始有不定芽 和胚状体的生成。一般情况下4周进行1次继代。在继代培养的过程中，如若发现在丛生 芽组织块上丛生小芽过多，则将2, 4-D浓度调整为3. 0 μ mol/1 ;如若发现在丛生芽组织块 上愈伤组织化较严重而不定芽很少，则将2,4-D浓度降至I. 0 μ mol/1，进行继代培养直至 产生大量的瘤状或指状突起（在A培养基上进行培养的组织块中，有少数材料可能会产生 不定根，不定根的出现与幼叶一样会影响到组织块的膨大和胚状体或丛生芽的产生，所以 要注意及时切除）。将丛生芽组织块再次转移到B培养基上培养2-3天后，其质地变得较为 柔韧，色泽则慢慢变黄。利用扫描电镜观察可看到各个时期的胚状体和不定芽。胚状体和 不定芽迅速发育，在其表面上产生丛生小芽。
[0125] 5)以丛生芽组织块为受体进行农杆菌介导的遗传转化
[0126] 将含有D8质粒的农杆菌GV3101在含有50mg/L Kan的LB液体培养基中震荡培养 (28°C，200rpm)至对数生长期。3500rpm，离心10min，弃上清。菌体用1/2浓度的液体种 子萌发培养基（种子萌发培养基成分浓度减半，且不加琼脂粉）进行洗涤，离心收菌。用含 100 μΜ/L的乙酰丁香酮的1/2浓度的丛生芽诱导培养基进行悬浮（稀释5-20倍）后用于 遗传转化。
[0127] 以准备好的已培养12-18天的丛生芽组织块为受体进行转化，转化后在黑暗处进 行恢复培养。将经农杆菌感染后的丛生芽或者组织块在含250mg/L头孢霉素（Cefotaxime) 的培养基上进行抑菌培养（黑暗处），然后将丛生芽或组织块转移到筛选培养基中进行筛 选（一般3-4代）。筛选过程中大量丛生芽组织块死掉，将存活的组织块转移到不含筛选剂 且不含2, 4-D的A培养基上进行培养，直至产生抗性小芽。
[0128] 将抗性小芽切下并转移到成苗培养基上培养（光强约2000-30001x，光照14-16h/ d)。当小苗至3-4叶期时再次转移到生根培养基中以诱导生根。将生根后的小苗移栽到蛭 石中进行生长（移栽时洗去粘附的培养基）。植株的生长条件为：自然光下，日温22-28Γ， 夜温16-21°C，隔天浇灌含1/2浓度的种子萌发培养基的无机盐成分的营养液。大约两周后 移植苗产生大量根系，最后将其定植在田间生长。
[0129] 6)转基因植株的鉴定
[0130] 取移栽成活的玉米植株的叶片提取DNA并进行PCR，将PCR结果为阳性的植株进一 步进行叶片的GUS染色。两者均为阳性的植株收获种子繁殖后代。玉米少量叶片DNA的提 取同实例3中烟草叶片的提取程序；PCR反应体系及程序和转基因玉米的GUS组织化学染 色程序同实例3中所述。
[0131] 7)以D8T3代转基因纯合玉米植株为材料，开展盐和干旱胁迫处理实验
[0132] 盐胁迫处理实验：将种子播种在砂盆中，从三叶期开始一半浇灌0. 7 % NaCl水溶 液，另外一半浇灌等量水作为阴性对照。在胁迫处理至1、3、7、10天后分别取材进行⑶S染 色和GUS酶活测定。实验结果表明D8在玉米种仍具有较高的启动基因表达的能力，并且明 显受到盐胁迫的诱导，为盐胁迫诱导型启动子。
[0133] 干旱胁迫处理实验：将种子播种在砂盆中，从五叶期开始一半植株开始进行控水 处理，另外一半怎浇灌适量水作为阴性对照。控水处理1、3、5、7天后取材进行⑶S染色和 GUS酶活测定。实验结果表明D8能够受到干旱胁迫的诱导，为干旱胁迫诱导型启动子。
[0134] 综上所述，D8在玉米中具有较高的启动基因表达的能力，且能够受到盐、干旱胁迫 的诱导，为盐和干旱胁迫诱导型启动子，在玉米的抗逆遗传改良中具有重要的应用价值。
【主权项】
1. 一种玉米II型H+_焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体，其特征在于：所述缺失突变 体是位于玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)起始密码子ATG上游的219bp的连续碱基 序列，该缺失突变体命名为玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)启动子的缺失突变体D8;其 中所述玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)启动子的核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示，所 述缺失突变体D8的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。2. 权利要求1所述玉米II型H+_焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体在提高植物抗逆 育种中的应用。3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的提高植物抗逆育种是通过利用玉米 II型H+-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体D8在植物体内启动抗逆基因的表达实现；其 中，所述植物抗逆是指植株在器官、组织、细胞或整株水平上表现出的抗旱或耐盐特征或其 组合，所述植物是指双子叶植物或单子叶植物。4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物是指小麦、棉花、大豆或烟 草；所述单子叶植物是指玉米或水稻。5. 权利要求1所述玉米II型H+_焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体在玉米耐盐和抗 旱育种中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种玉米Ⅱ型H+-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体及其应用，其中所述缺失突变体是位于玉米II型H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)起始密码子ATG上游的219bp的连续碱基序列，该缺失突变体命名为玉米Ⅱ型H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体D8；所述玉米Ⅱ型H+-焦磷酸酶基因启动子的核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示，所述缺失突变体D8的核苷酸序列如SEQ？ID？No.2所示。实验证实，本发明的D8启动子能够启动下游基因在转基因植物受体中较高水平表达，且具有明显的盐和干旱胁迫诱导特性，在植物耐盐、抗旱基因工程育种中具有很好的应用价值。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/113
【公开号】CN105177008
【申请号】
【发明人】李坤朋, 侯加佳, 张举仁, 姜平平, 亓守美, 管赟赟, 张珂
【申请人】山东大学
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2015年11月4日