TTAGG-3'。下游引 物为 5' -CCGGAA TTCGATGGAATATGAGTTTG-3'。
[0045] 3)以含全长启动子序列的质粒为模板，PCR扩增获得不同长度的启动子片段。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收（具体步骤参考其说明 书）。
[0046] PCR反应体系：5XPCR反应缓冲液（含Mg2+)5yL，引物I (ΙΟμΜ)ΙμL，引物 II (10 μ Μ) 1 μ L，dNTP (2. 5mM)，2 μ L，高保真 DNA polymerase (5U/ μ 1) 0· 25 μ L，质粒 1 μ L， ddH20 补足至 25yL。
[0047] PCR程序：95 °C预变性5分钟；95 °C变性1分钟；56 °C退火1分钟；72 °C延伸1. 5分 钟（可依据序列长短进行适当调整）；35个循环；最后72°C延伸5分钟。
[0048] 4)将目的DNA片段和表达载体pCAMBIA1391Z用Hind III和EcoR I两种限制性内 切酶进行双酶切（限制性内切酶购自Fermentas公司，具体酶切条件和程序参见说明书）。 酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收（具体步骤参考其 说明书）。
[0049] 5)将4)中获得的酶切后的目的DNA片段与载体进行连接。通常目的DNA片段与 质粒载体连接时的摩尔比为3:1~5:1，连接体系如下：10Xbuffer 2yL，T4DNA Ligase 1 μ L，载体50-100ng，DNA片段与载体摩尔比对应的量，ddH20补足至20 μ L。轻轻混匀，置 于？0?仪中，程序为22°(：条件下1〇1^11，65°(：条件下1〇1^11，10°(：条件下1〇1^11。连接产物可 直接用于大肠杆菌的转化。
[0050] 6)大肠杆菌的转化
[0051] -70°C冰箱中取出50 μ L感受态大肠杆菌置于冰上，加入连接产物，轻轻混匀；冰 浴30min，同时融化固体培养基，待冷却到50°C左右时加入Kan (50mg/L)，倒平板；42°C热 激90s，随后迅速将小管冰浴2min ;向管中加入700 μ L无菌的液体LB培养基（不含抗生 素）混匀后放入摇床，37°C，180-200rpm，lh，使其复苏；在上述倒好的平板表面上将100 μ L 1卩丁6(0.11)和20以1^(-831(2011^/1]11^涂抹均勾，用于后续的蓝白斑筛选；复苏完，5000印111， 离心3min，将上清吸至剩余约100 μ L左右，轻轻用枪吹打沉淀使菌散开；将其涂布于步骤 准备好的平板上，倒置平板，放入培养箱中，37°C，过夜暗培养；挑取单克隆摇菌，保菌并提 取质粒进行酶切鉴定，酶切正确的质粒进一步进行测序确认。
[0052] 7)农杆菌的转化
[0053] 25mL YEP 培养基（含利福平 50mg/L)接入约 100 以1^农杆菌6￥3101，28°(：，200印111， 过夜培养；次日，取2mL菌液加入到25mL含利福平50mg/L的YEP培养基中，培养至OD值0. 8 左右；将菌液分装到两个7mL管中，每个5mL，置于冰上30min，在此过程中配20mM的CaCl2于7mL管中，混匀后放置在冰上备用；菌液5000rpm离心10min，收菌弃上清，每管加入2mL 0. 15mol/L NaCl (灭菌且在4°C预冷），轻轻弹起；4°C，5000rpm，离心10min，弃上清，每管加 入200 μ L 20mmol/L的CaCl2，轻轻弹起，混勾后合并成一管，以200 μ L每管分装于I. 5mL 离心管中；每管中加入8 yL左右重组质粒，轻弹并混匀，静置冰浴30min ;液氮速冻90s，迅 速置入37°C水浴锅3min ;加入ImL未加抗生素的YEP培养基，28°C，180rpm复苏Ih ;融化 YEP固体培养基，冷却至50°C左右，加入利福平和Kan (均为50mg/L)倒平板；5000rpm，离心 3min收菌涂平板，28°C，倒置暗培养约2天；挑单克隆，鉴定正确后保菌备用。
[0054] 实施例3 :本生烟草的转化及转基因植株的获得
[0055] 1)农杆菌介导的烟草叶盘转化的具体步骤如下：
[0056] (1)农杆菌阳性菌株过夜培养至对数生长期（0D600 = 0· 6左右）。
[0057] (2) 5000rmp离心10分钟，菌体用相同体积的A2液体培养基悬浮。
[0058] (3)将提前培养好的烟草无菌苗叶片切割成大约2. 5mm2的小块，置入A2悬浮的菌 液中，浸染8-10min左右。
[0059] (4)取出叶片，置于无菌滤纸上吸干多余的菌液后转移至A2固体培养基上，26°C 暗培养2-3天。
[0060] (5)共培养后的叶片切块转移至含15mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的A3选 择培养基上，每隔7~9天继代1次，连续筛选3代。
[0061] (6)切下抗性小芽转移至含200mg/L头孢霉素的A4培养基上壮苗。
[0062] (7)将（6)中小苗转移至A5生根培养基中诱导生根。
[0063] (8)生根小苗长到5~6厘米左右后移栽到购买的营养土中。
[0064] 烟草转化用的培养基如下：
[0065] Al培养基（无菌苗培养基）：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，1 %蔗 糖，0.7%琼脂，？!15.8-6.0;
[0066] A2培养基（浸染培养基）：B5培养基成分，250mg/L NH4NO3, 3%蔗糖，0· 5g/L MES， 0.7%琼脂（;1^(^卩1&七6)，卩!15.8-6.0;
[0067] A3培养基（诱导丛生芽培养基）：B5培养基成分，250mg/L NH4NO3, 2%蔗糖，0· 5g/ L MES，lmg/L 6-ΒΑ，0· lmg/L ΙΑΑ，0· 7%琼脂，ρΗ5· 8-6. 0 ;
[0068] Α4培养基（壮苗培养基）：Α3培养基，去掉ΙΑΑ，ρΗ5· 8-6. 0 ;
[0069] Α5培养基（生根培养基）：1/2浓度MS培养基无机盐，MS培养基维生素，3%蔗糖， 0· 5g/L MES，0. 7%琼脂，ρΗ5· 8-6. 0。
[0070] 2)转基因植株的鉴定
[0071] 分化小苗移栽后首先进行PCR检测，PCR阳性植株进一步进行⑶S染色鉴定，两者 均为阳性的植株用于收获后代种子
[0072] (I)PCR 检测
[0073] CTAB法提取烟草叶片基因组DNA :取适量叶片置于小管中，液氮冷冻后用小型DNA 研磨仪研磨；加入400 μ L 65°C预热的2XCTAB并混匀，65°C温育40min，中间不间断混匀； 取出冷至室温后加入400 μ L氯仿：异戊醇（24:1)的混合液抽提IOmin ;取上清约200 μ L 加入含有400 μ L 4°C预冷的无水乙醇的1.5ml离心管中，颠倒混匀，-20°C静置30min ; 12500rpm，4°C，离心10min ;沉淀用70%的乙醇洗两次（第一次15min，第二次至少3h或 过夜）；DNA晾干后加适量无菌水或TE溶液，65°C水浴溶解30min以上；将提取好的DNA置 于-20°C冻存备用。
[0074] PCR反应体系：PCR反应缓冲液（含Mg2+)2.5yL;引物I (ΙΟμΜ)ΙμΜ引物 II (10yM)lyL;dNTP(10mM)0.5yL;Taq DNA 聚合酶（5U/yl)0· 125yL;DNA 模板 IyL; ddH20 补足至 25 μ L。
[0075] PCR 反应程序：95°C预变性 5min ;95°C变性 Imin ;58°C退火 Imin ;72°C延伸 Imin ; 35个循环；最后72°C延伸5min。
[0076] (2)⑶S组织化学染色
[0077] ⑶S 染色液的配制：0· IM 磷酸缓冲液（pH = 7. 0)0· 5mL，Fe2+IOyL, Fe3+IOyL, Trition-100(10% ) 10 yL，EDTA(0. 5M，pH = 8· 0)20 yL，X-GLUC 20 yL，H2O 补足至 lmL。
[0078] ⑶S染色的具体步骤：用打孔器取适当大小的叶片，浸入上述⑶S染液中；避光条 件下0. 05MPa抽真空约15min ;37°C染色10_16h ;用70%的乙醇脱色后观察。
[0079] 实施例4 :D1~D9转基因烟草的⑶S酶活测定
[0080] 为进一步明确不同长度的启动子片段在正常条件下启动基因表达的能力，便于后 续筛选ZmVP2启动子中驱动目的基因高效表达的核心序列区段，我们以D1-D9突变体烟草 叶片为材料进行了 GUS酶活测定。
[0081] 1)⑶S酶活测定相关试剂的配制
[0082] 反应缓冲液：0.1 M磷酸缓冲液（p