H = 7. 0) 50mL，10 %十二烷基肌氨酸钠 lmL，0. 5M EDTA(pH = 8.0)2mL，10%Trition lOOlmL，β-巯基乙醇 100yL，水补至 100mL。
[0083] IOmM 4-MUG母液的配制：5mg 4-MUG加到I. 42mL反应缓冲液中。
[0084] ImM 4-MUG检测液的配制：450 μ L反应缓冲液+50 μ L 10mM/L 4-MUG母液。
[0085] 反应终止液（0· 2mol/L NaC03) :NaC0310. 6g，水定容至 500mL。
[0086] 2)⑶S酶活标准曲线的制定
[0087] 用反应终止液将ImM的4-MU母液稀释成10nM，lOOnM，500nM，1 μ M，2 μ M，4 μ M的 浓度梯度，利用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm，扫描时间10s，狭缝宽 度5nm，电压550V的条件下测定各浓度溶液的荧光值，并绘制标准曲线。
[0088] 3)⑶S荧光活性的测定
[0089] 用打孔器取适量叶片，加 ImL 4°C预冷的反应缓冲液快速磨碎，转入I. 5ml离心管 中置于冰上约l〇min，期间不断颠倒混勾；12500rpm，4°C，离心10min ;取100 μ L上清加入 到37°C预热的ImL检测液中迅速混勾，即刻取出80 μ L加入到720 μ L反应终止液中终止 反应，并将该管的酶活值作为酶促反应空白对照。剩余上清液用于蛋白含量的测定；分别 在10min、20min、30min、40min、60min时取出80 μ L上述检测液加入到720 μ L终止液中， 并迅速混匀；利用荧光分光光度计测定上述终止液的荧光值，测定条件是激发波长365nm、 发射波长455nm，狭缝宽度5nm，扫描时间10s，电压550V ;各样品酶活力的计算（单位：nM 4-MU/min mg protein):依据上述2)中绘制的标准曲线求出相应的4-MU含量，以反应时间 对4-MU的含量作图，直线部分的斜率为酶反应的速率。
[0090] 4)蛋白含量的测定
[0091] 取叶片提取液30 μ 1，采用Bradford法测定蛋白含量（Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein - dye binding. Ann. Biochem. , 1976? 72:248 - 254.) 〇
[0092] 酶活测定结果显示D1-D9在转基因烟草叶片中启动⑶S表达的能力上存在很大差 异。D1-D3突变体植株启动⑶S表达的能力最弱，D4的酶活性可达到D3的4倍左右，D4-D9 的GUS荧光活性相对较强，其中D8在ZmVP2启动子的系列缺失片段中表现出了最高的启动 子活性，可达到全长启动子Dl的6倍左右。D8片段（-219至-Ibp)为ZmVP2基因起始密码 子ATG上游的219bp的DNA序列，该片段可能是ZmVP2启动子高效启动基因表达的关键序 列（见附图3)。
[0093] 实施例5 :D1~D9转基因本生烟草的盐胁迫响应特性分析
[0094] 1)选取生长状态一致的8周龄大小的D1-D9转基因 T3代纯合株系植株和WT (阴 性对照）为材料。
[0095] 2)盐胁迫处理组浇灌含200mM NaCl的1/2MS营养液，对照组浇灌等量的1/2MS营 养液，实验设7个重复。
[0096] 3)胁迫处理24h后分别收取处理组和对照组植株相同部位的叶片，进行⑶S组织 化学染色和荧光活性测定。
[0097] 4) D1-D3和WT植株叶盘⑶S染色24h，D4-D9植株叶盘⑶S染色6h后脱色拍照观 察；⑶S组织化学染色具体步骤按照实例3中的程序进行。
[0098] 5)对GUS酶活测定结果统计分析，计算其酶活速率；GUS酶活测定具体步骤按照实 例4中的程序进行。
[0099] 结果表明D1-D8突变体烟草在200mM NaCl处理24小时后其叶片⑶S荧光活 性可达到处理前的2. 4倍左右，即D1-D8启动子片段具有明显的盐胁迫诱导特性，而D9 突变体在盐胁迫前后其酶活强度无显著差异。上述结果表明了 D8和D9之间的片段 (-219~-149bp)极有可能存在着盐胁迫响应相关元件。酶活结果也进一步明确了盐胁迫 处理前后D8启动子片段在D1-D9系列缺失片段中均具有最高的启动子活性，在盐胁迫前后 D8突变体中的⑶S酶活性均可达到全长启动子Dl的5. 8倍左右。在正常条件下D8突变体 叶片的⑶S酶活性是D9的1. 4倍左右，而盐胁迫处理24h后可达到D9的3. 3倍左右。该 结果表明了 D8片段（219bp)为ZmVP2启动子启动基因高效表达的关键序列区段，而且伴随 着较高的盐胁迫响应特性，为盐胁迫诱导性启动子。盐胁迫下D8片段启动目的基因表达可 达到一个较高的水平，在作物耐盐基因工程育种中体现出了很好的应用前景。
[0100] 实施例6 :D1~D9转基因本生烟草的干旱胁迫响应特性分析
[0101] 1)选取生长状态一致的8周龄大小的D1-D9转基因 T3代纯合株系植株和WT (阴 性对照）为材料。
[0102] 2)实验组控水，对照组根据具体情况浇适量水，实验设7个重复。
[0103] 3)干旱胁迫处理24h后分别收取处理组和对照组植株相同部位的叶片，进行⑶S 组织化学染色和荧光活性测定。
[0104] 4) D1-D3和WT植株叶盘⑶S染色24h，D4-D9植株叶盘⑶S染色6h后脱色拍照观 察；⑶S组织化学染色具体步骤按照实例3中的程序进行。
[0105] 5)对GUS酶活测定结果统计分析，计算其酶活速率；GUS酶活测定具体步骤按照实 例4中的程序进行。
[0106] 结果表明D1-D8突变体烟草在干旱处理24h后其叶片⑶S荧光活性可达到处理前 的2. 0倍左右，明确了 D1-D8片段的启动子活性受渗透胁迫的诱导。干旱处理24h的D9突 变体转基因烟草的GUS荧光活性与未处理的对照相比却无显著差异。上述结果表明D8与 D9之间的71bp片段（-219至-149bp)极有可能存在着干旱胁迫响应相关元件。此外，⑶S 酶活结果也表明了干旱胁迫前后D8片段在D1-D9系列启动子片段中均具有最高的启动基 因表达的能力，胁迫前后均可达到全长启动子Dl的6倍左右。正常条件下D8突变体叶片 的⑶S酶活性是D9的I. 4倍左右，而干旱胁迫处理24h后可达到D9的3. O倍左右。该结 果表明了 D8片段（219bp ;-219至-Ibp)是ZmVP2启动子中具有干旱胁迫诱导活性的高效 启动基因表达的关键序列，在作物抗旱育种中具有很好的应用潜质。
[0107] 实施例7 :80bp (-219~-140bp)片段的干旱和高盐胁迫诱导活性验证
[0108] 1)为防止高盐/干旱胁迫响应元件位于D8和D9之间的71bp的右边界，我们 向右顺延了 9个碱基。依据80bp DNA序列设计引物（引入酶切位点BamHI和PstI): 上游引物为 5' -TAAGGATCCGTAGGCTTGACGGCA-3'，下游引物为 5' _ AAACT GCAGGTAAACACA TCCAGA-3'。PCR扩增片段连入mini35S启动子（-46至+IObp)上游启动⑶S表达，命名为 P-80bp-mini35S。质粒经鉴定正确后转入农杆菌GV3101中，用于后续烟草的瞬时转化。
[0109] 2)携带mini35S和P-80bp-mini35S质粒的农杆菌GV3101培养至对数生长期 (0D600 = 0· 6左右）。5000rpm，常温下离心10min收菌，弃上清，沉淀用等体积含IOmM MES， IOmM MgSOjP 100 μM AS的水溶液重悬，黑暗处室温下静置3h以上。
[0110] 3)将静置后的菌液轻轻混匀，通过叶脉注射法瞬时转化烟草叶片，每个菌株注射 30株烟草，注射后烟草植株置于培养室中恢复24h。
[0111] 4)取注射侵染过的叶片中心区域，用打孔器取材，1/3叶盘作为对照置于1/2MS溶 液中；1/3叶盘置于含200mM NaCl的1/2MS溶液中进行盐胁迫处理；1/3叶盘置于含18% PEG 6000的1/2MS溶液中模拟干旱处理。
[0112] 5)处理24h后，每个植株胁迫处理的和未处理的叶盘各取5片，⑶S染色24h后拍 照观察；同时各取5片用于GUS酶活测定，统计其酶活速率。
[0113] 实验结果表明P-80bp-mini35S质粒侵染的烟草叶盘在盐和PEG胁迫处理24h后 的⑶S酶活性分别达到处理前的2. 5倍和2. 2倍，而mini35S启动子质粒侵染的烟草叶盘 在盐和PEG胁迫处理前后的⑶S酶活无显著变化。说明上述80bp片度