-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体及其应用

文档序号:8959489阅读:1339来源:国知局
-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明归属于植物基因工程和分子生物学技术领域,尤其涉及一种玉米II型 H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体D8及其应用。
【背景技术】
[0002] 植物生长发育中经常遭受逆境胁迫,其中干旱、高盐等已成为限制农业发展的重 要因素。据《中国水旱灾害公报》统计,每年我国有1200万公顷以上的耕地遭受不同程度 的干旱胁迫,造成粮食减产约200多亿公斤,占农作物减产总量的60 %以上;在我国16亿 亩耕地中,盐碱地约占1亿多亩,并且呈现逐年增加趋势。发掘并克隆重要功能基因和调控 元件,采用转基因技术培育作物抗逆新品种是保证粮食高产、稳产的有效措施。
[0003] 近年来,我国已经克隆了一批抗逆基因并用于作物转化,相对而言我国具有自主 知识产权的启动子的种类及数量较少,尚不能满足多基因转化的需求。目前国内外用于作 物遗传转化的启动子主要是一些组成型启动子,如玉米泛素(Ubiquitin)基因启动子、花 椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和水稻肌动蛋白(Actin)基因启动子。这些启动子调控目 标基因在所有组织中表达,且没有时空限制,导致大量目标蛋白在不需要的细胞或发育阶 段大量累积,时常造成转基因作物的形态和生理功能异常等,例如Nakashima等利用玉米 Ubiquitin启动子在水稻中过表达0sNAC6基因,转基因水稻的抗逆性提高,但同时也导致 其植株生长期延长,产量降低。
[0004] 植物正常的生长发育需要基因的特异性表达,基因的表达调控可发生在染色体、 转录、转录后等多个层次水平,其中转录水平上的调控是基因表达调控的一个关键环节,通 过顺式作用元件与反式作用因子互作实现。启动子是包含多个顺式作用元件,起始并调控 基因转录的一段DNA序列,在基因转录的精确起始和转录效率调控方面发挥重要作用。随 着对转基因植物生物安全性要求的提高,同时植物生长发育调控也需要目标基因的特异性 表达,诱导型和组织特异型启动子已备受关注。组织特异性启动子可调控目标基因的转录 一般只发生在某些特定的器官或组织中,诱导型启动子可根据需要在植物特定的发育阶段 或特定的生长环境下快速启动基因转录,即根据植物的实际需求实现目标基因的时空或组 织特异性表达,在植物转基因育种中展现出了广阔的应用前景。尽管组织特异性和诱导型 启动子与组成型启动子相比在外源基因的精准表达调控方面体现出了独特的优势,但鉴于 我国具有自主知识产权的胁迫诱导性启动子资源匮乏,且对其启动子序列上的顺式作用元 件缺乏系统的了解,限制了我们对其有效利用,目前已成为作物转基因抗逆遗传改良的瓶 颈之一。因此,发掘并分离胁迫诱导型启动子,筛选鉴定其核心功能区段及特异性调控序列 具有重要意义。
[0005] H+-焦磷酸酶是一种与H+-ATPase不同的H+转运酶,在植物、藻类和光合细菌中广 泛存在。植物中H+-焦磷酸酶多定位于液泡膜上,其主要功能是利用水解焦磷酸产生的自 由能将H+从胞质转运到液泡中,起到质子栗的作用,为物质的跨液泡膜运输提供能量,同时 起到酸化液泡的作用。已有的研究表明该酶参与植物逆境胁迫响应及生长发育调节。根据 H+-焦磷酸酶对金属离子的敏感性差异,将其分为两类:一类是对K+敏感而对Ca2+不敏感的 I型H+-焦磷酸酶;另一类是对Ca2+敏感而对K +不敏感的II型H +_焦磷酸酶。Sarafian等 (1992年)首次克隆了拟南芥AVPl基因,是I型H+-焦磷酸酶的典型代表。目前对I型H+-焦 磷酸酶的研究较多,已从多种植物中克隆出了该酶,其氨基酸序列具有高度相似性,可达到 80%以上,该酶广泛参与植物的抗逆性。Carystinos等(1995年)报道水稻I型H+-焦磷 酸酶基因在缺氧和冷胁迫下转录水平显著上调,解除胁迫后该基因的表达随之恢复至正常 水平。Wang等(2001年)用400mM NaCl处理盐地碱蓬发现其I型H+-焦磷酸酶的活性受 到显著影响。Guo等(2006年)在拟南芥中过表达碱蓬I型H+-焦磷酸酶基因 SsVP导致其 耐盐、抗旱性显著提高。Gao等(2006年)从盐芥中克隆了 I型H+-焦磷酸酶基因,命名为 TsVP,在烟草中过表达该基因导致其耐盐和抗寒能力显著提高。Li等(2008年)在玉米中 过表达盐芥TsVP基因,转基因玉米的耐旱性得到显著的提高。
[0006] 与I型H+-焦磷酸酶相比,II型H+-焦磷酸酶的研究相对较少。Oberbeck等(1994 年)利用免疫电镜技术在玉米根细胞高尔基体上发现了 II型H+-焦磷酸酶的存在,但其基 因未被克隆。Drozdowicz等(2000年)从拟南芥中克隆了第一个II型H+-焦磷酸酶基因 (AVP2),与拟南芥I型H+-焦磷酸酶的序列相似度仅为35% ,Mitsuda等(2001年)发现其 定位于高尔基体膜上。本实验室的岳桂东等(2008年)从玉米中克隆了 II型H+-焦磷酸酶 基因 ZmVP2 (Genebank accession :EF051578. 1),其编码的氨基酸序列具有H+-焦磷酸酶的 保守结构域,与拟南芥II型H+-焦磷酸酶的氨基酸序列相似性为89%,但与玉米I型H+-焦 磷酸酶的氨基酸序列相似度仅为39 %,转录表达分析表明该基因受干旱、高盐等逆境胁迫 的显著诱导,且表达丰度较高。基因的转录表达与启动子密切相关,克隆ZmVP2的启动子序 列,分析其高盐和干旱胁迫响应特性,发掘该启动子的核心功能区段及胁迫响应元件具有 重要理论意义和很好的应用前景。

【发明内容】

[0007] 针对目前的研究现状,本发明主要解决的问题是提供一种可用于植物基因工程育 种的高盐和干旱胁迫诱导性的玉米II型H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突变体 D8及其应用。
[0008] 本发明所述的玉米II型H+-焦磷酸酶基因启动子的缺失突变体,其特征在于:所 述缺失突变体是位于玉米Π 型H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)起始密码子ATG上游的219bp的 连续碱基序列,该缺失突变体命名为玉米II型H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的缺失突 变体D8 ;其中所述玉米II型H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示,所述缺失突变体D8的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0009] 上述玉米II型H+-焦磷酸酶基因的启动子序列是从水分胁迫下苗期玉米叶片的 抑制性消减文库中筛选并首先克隆了 ZmVP2基因的cDNA序列,利用该cDNA序列在NCBI数 据库中与玉米高通量基因组数据进行BLAST比对,获取的ZmVP2基因5'端上游1468bp的 核苷酸序列,其为高盐和干旱胁迫诱导型启动子。
[0010] 利用启动子在线分析软件PLANTCARE和PLACE对ZmVP2基因的启动子序列进行分 析,发现在该启动子1468bp序列上存在35个可能起作用的顺式元件,包括光响应元件、脱 落酸及茉莉酸甲酯等激素响应元件、低温等逆境胁迫响应元件等(见附图1)。依据上述分 析结果及碱基序列,设计ZmVP2启动子5'系列缺失突变体引物,同时在上下游引物的5' 端分别引入Hind III和EcoR I酶切位点,利用PCR扩增获得不同长度的启动子缺失片段, 利用两端的酶切位点将启动子系列缺失片段定向连入植物表达载体PCAMBIA1391Z中GUS 报告基因上游的多克隆位点处,构建ZmVP2启动子的系列缺失植物表达载体(见附图2中 Dl~D9启动子片段与GUS基因的连接示意图,ATG中的A为+1)。将上述构建好的植物表 达载体导入大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序确认,鉴定正确后将上述质粒分别命 名为:Dl、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8和D9,其中Dl为ZmVP2全长启动子,其核苷酸序列如 SEQ ID No. 1所示;缺失突变体D8启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0011] 上述用于构建ZmVP2启动子5'端系列缺失突变体的核酸序列可为全长启动子序 列Dl ;亦可为该启动子的片段序列D2-D9 ;也可为人工修饰改造后仍具有类似该启动子活 性的喊基序列。
[0012] 将上述D1-D9质粒导入农杆菌GV3101中,鉴定正确后用于后续烟草或玉米等作物 的遗传转化。
[0013] 鉴于从事相关研究的本领域专业人员很容易通过定向进化或者点突变等方法对 本发明中所表述的启动子及其缺失突变体的碱基序列进行突变,那些经过人工修饰改造但 具有与本发明中提供的启动子片段核酸序列同源性2 60%且仍具有启动子活性的碱基序 列均视为本发明所述启动子核苷酸序列衍生物,等同于本发明所述序列,属于本专利保护 的范畴。
[0014] 含有上述启动子及其缺失片段的重组载体、转基因细胞系、重组菌和转基因植株 均属于本专利保护范围之内。
[0015] 本发明所描述的玉米II型H+-焦磷酸酶基因(ZmVP2)启动子及其缺失突变体D8 在提高植物抗逆育种中的应用。
[0016] 其中:所述的提高植物抗逆育种是通过利用玉米I
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