I型H+-焦磷酸酶基因启动子 的缺失突变体D8在植物体内启动抗逆基因的表达实现；其中，所述植物抗逆是指植株在器 官、组织、细胞或整株水平上表现出的抗旱或耐盐特征或其组合，所述植物是指双子叶植物 或单子叶植物。所述双子叶植物是指小麦、棉花、大豆或烟草；所述单子叶植物是指玉米或 水稻。
[0017] 本发明是利用实验室已经克隆的玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)的cDNA 序列与NCBI数据库中的玉米高通量基因组数据进行BLAST，最终获得该基因 V端上 游1468bp的碱基序列作为全长启动子D1，以此核苷酸序列为模板设计5'端系列缺 失引物，PCR扩增得到不同长度的启动子缺失片段D2-D9,将其分别连入植物表达载体 PCAMBIA1391Z中GUS报告基因上游的多克隆位点处，通过农杆菌介导的遗传转化法转化本 生烟草。
[0018] 具体来讲，是将H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)全长启动子Dl及不同长度的缺失片段 D2-D9分别构建植物表达载体，利用农杆菌介导的叶盘转化法转化本生烟草，转化叶盘在含 有潮霉素的培养基上诱导和筛选抗性细胞、分化小苗。分化的小苗进一步经PCR检测和GUS 组织化学染色鉴定，两者均为阳性的植株收获后代种子进行繁代，后代进行遗传学分析，根 据其分离比筛选出T2/T3代单拷贝纯合株系用于后续实验。
[0019] 通过对D1-D9转基因烟草进行高盐和干旱胁迫处理实验，明确了 Dl及其缺失突变 体D2-D8为高盐和干旱胁迫诱导型启动子。其中D8序列仅219bp，在D1-D9中启动子活性 最高（见附图3)，并且能够赋予目的基因在转化的细胞中具有明显的高盐和干旱胁迫诱导 特性（见附图4和5)，为具有较高启动基因表达活性的高盐和干旱胁迫诱导性启动子。
[0020] D8与D9之间的80bp(-219至-140bp)序列是ZmVP2启动子具有高盐和干旱胁迫响 应特性的关键序列，将该80bp序列连接至mini35S启动子前边启动⑶S基因的表达，瞬时 转化本生烟草叶片，检测高盐和干旱胁迫前后GUS基因的表达强度，发现该SObp序列足以 赋予mini35S启动子高盐和干旱胁迫诱导特性，进一步证明了该80bp序列足以赋予D1-D8 启动子高盐和干旱胁迫诱导活性（见附图6)。
[0021] 将筛选获得的D8启动子片段转入玉米中，潮霉素筛选、PCR检测和⑶S组织化学 染色筛选出阳性植株，连续自交结实获得纯合系种子用于后续的基因表达分析。检测D8启 动子调控下的⑶S表达模式，明确D8在玉米中也能够高效驱动目的基因的表达。对D8转 基因玉米进行高盐和干旱胁迫处理，可显著提高GUS基因的表达水平，表明D8启动子片段 是高盐和干旱胁迫诱导型高表达启动子，在玉米抗逆育种中具有很好的应用前景。
[0022] 综上所述，在本发明中公开了玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)启动子Dl的 序列，构建了启动子Y系列缺失植物表达载体D2-D9,检测D1-D9在转基因烟草中启动GUS 报告基因的特性，确定了 D8具有较高的启动子活性，且具有明显的高盐和干旱胁迫诱导特 性。进一步在转基因玉米中检验D8启动子的特性，发现D8在玉米中也能够很好地发挥功 能，是高盐和干旱胁迫诱导性高表达启动子。本发明的主要价值和效果体现在以下几个方 面：
[0023] 1)为植物耐盐、抗旱转基因育种提供胁迫诱导性启动子D8,该类启动子正是作物 耐盐、抗旱遗传改良中所需要的。
[0024] 2) D8启动子在正常环境下维持基因表达在相对较低的水平，而在植物受到高盐或 干旱胁迫时可提高抗逆基因的表达达到正常条件下的2倍以上，以提高植物的抗逆性，因 此该D8启动子可在一定程度上实现抗逆基因的"适时"表达，在提高植株抵抗外界不良环 境的能力的同时减少宿主细胞不必要的能量浪费和对植株正常生长的影响，以促进胁迫条 件下作物产量的形成。
[0025] 3)D8启动子不仅具有高盐和干旱胁迫诱导特性和较高的启动基因表达能力，而且 其序列仅有219bp，便于基因的重组和植物的遗传转化。
[0026] 4) D8与D9之间的80bp碱基序列中含有未被报道的高盐或干旱胁迫响应顺式作用 元件，该序列可为以后人工改造和创制新的启动子提供有用资源。
【附图说明】
[0027] 图1 :玉米II型H+-焦磷酸酶基因（ZmVP2)启动子的碱基序列及生物信息学分析 结果。
[0028] 图2 :不同长度的ZmVP2启动子片段与⑶S报告基因的连接示意图（ATG中的A为 +1) 〇
[0029] 图3 :正常条件下D1-D9转基因本生烟草叶片的⑶S酶活测定结果。
[0030] 图4 :盐胁迫处理前后D1-D9转基因烟草植株⑶S酶活测定结果。
[0031] 图5 :干旱胁迫处理前后D1-D9转基因烟草植株⑶S酶活测定结果。
[0032] 图6 :筛选获得的80bp (-219至-140bp)序列的盐/干旱胁迫诱导活性验证。
【具体实施方式】
[0033] 以下将通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅限于以下具 体实施例。下述实施例中所述方法内容若无特殊说明，则均为常规性实验方法。
[0034] 实施例1 :ZmVP2启动子序列的克隆
[0035] 1)实验室从水分胁迫下苗期玉米叶片的抑制性消减文库中筛选并克隆了 ZmVP2 基因的 cDNA 序列，此序列已经提交至 GenBank database(Genebank accession : EF051578. 1)〇
[0036] 2)利用ZmVP2基因的cDNA序列在玉米高通量基因组数据库中进行Nucleotide blast分析，获得ZmVP2基因起始密码子ATG上游约I. 5kb的核酸序列用于该启动子克隆的 引物设计与筛选。
[0037] 3)依据上述序列，利用PMMER5. 0设计PCR引物。上游引物为5' CCTGACTTAATCGCAC 3' ；下游引物为 5'GATGGAATATGAGTTTG 3'。
[0038] 4)采用CTAB法提取玉米基因组DNA，具体参见《分子克隆实验指南III》，以提取的 DNA为模板进行PCR，反应体系如下：
[0039] PCR 反应体系为 IOmM Tris.Cl，1.5mM MgCl2,50mM KCl，200 yM dNTP each，0.8yM 引物，0.625U高保真DNA polymerase，IyL模板，无菌水补足25 yL。反应程序为：95°C预 变性5分钟；95 °C变性1分钟，55 °C退火1分钟，72 °C延伸1. 5分钟，35个循环；最后72 °C延 伸5分钟。
[0040] 5)PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后使用Axygen公司的凝胶回收试剂盒回收目的条 带，凝胶回收具体步骤参见其说明书。利用全式金公司的基因克隆试剂盒将目的片段连接 至Ij pEASY-B克隆载体上转化Trans-I感受态大肠杆菌（试剂盒配套菌株），具体参照试剂盒 说明书进行。向转化的大肠杆菌管中加入约Iml LB培养基37°C 200rpm振荡培养1小时， 4000rpm离心5min收菌涂板，涂板用的培养基中含有50mg/L的Kan (用于筛选阳性克隆）， 其表面均匀涂布有IPTG和X-gal，进行蓝白斑筛选。
[0041] 6)挑取6-8个白色克隆，在含有50mg/L Kan的LB液体培养液中震荡培养过夜，次 日提取质粒并进行酶切鉴定，质粒的提取参见《分子克隆实验指南III》24- 28页，酶切鉴定 按照Ferments公司的酶的说明书进行。酶切正确的质粒送交上海生工测序确认，进一步确 认该克隆的正确性。
[0042] 实施例2 :ZmVP2全长启动子及缺失突变体的植物表达载体构建和大肠杆菌及农 杆菌的转化
[0043] 1)利用PLANTCARE和PLACE启动子在线分析软件对ZmVP2的全长启动子序列进行 生物信息学分析，发掘其序列上可能存在的顺式作用元件。
[0044] 2)依据生物信息学分析结果及其全长启动子序列，利用primerf.O软件设计 ZmVP2全长启动子及系列缺失突变体的引物，共9对，同时引入Hind III和EcoR I酶切位 点，以便于后续的质粒重组。上游引物分别为Y -CCCAAGCTTCCTGACTTAATCGC AC-3 '; 5 r -CCCAAGCTTTTTGTTGGGCTTAGTG-3 r ；5 r -CCCAAGCTTGCTTCG TTGCTGCCTT-3 r ； 5 r -CCCAAGCTTTCGT GAA ATCAAGTGG-3 r ；5 r -CCCAAGC TTTAGAATCGCTACTTGC-3 r ； 5 r CCCAAGCTTCTACTGCCATTGTCAC-3 ' ' -C CCAAGCTTAGAAGGTGTCTGGGTA-3 r ； 5' -CCCAAGCTTGTAGGCTTGACG G CAA-3，；5' -CCCAAGCTTGTGTTTAACTT