）在0.003%~0.500%范围内 (例如在〇? 003%~0? 400%范围内、例如在0? 003%~0? 300%范围内、例如在0? 003%~ 0. 250%范围内、例如在0. 003%~0. 200%范围内、例如在0. 003%~0. 150%范围内、例如 在0. 003%~0. 130%范围内）时，这些原料药或药物制剂在长时间贮藏后杂质Iz含量增 加速度得到显著抑制，这是完全出人意料的。
[0046] 尽管本发明涉及的各种化学物质，例如式I化合物及其对映体、杂质lx、杂质Iy、 杂质Iz，它们的化学结构是已知的并且可以从市场上以商业途径直接获得，但是本领域技 术人员公知，这些杂质还可以通过规定的高效液相色谱法来定性或表征，例如通过规定的 高效液相色谱法操作，通过测定杂质在该规定高效液相色谱法中的保留行为（即相对保留 时间，RRT)来确定该杂质。特别是，本发明已经发现，在本发明所述【HPLC-A】系统中，相对 于式I化合物而言，杂质Ix的相对保留时间在0. 86~0. 92范围内（通常RRT大约0. 89)， 从而本发明亦可将该杂质Ix称为RRT0. 89杂质、杂质RRT0. 89、或RRT0. 89。
[0047] 而在本发明所述【HPLC-B】系统中，相对于式I化合物而言，杂质Iy的相对保留时 间在1. 10~1. 18范围内（通常RRT大约1. 14)，从而本发明亦可将该杂质Iy称为RRTL 14 杂质、杂质 RRTl. 14、或 RRTL 14。
[0048] 另外，在本发明所述【HPLC-B】系统中，相对于式I化合物而言，杂质Iz的相对保 留时间在2. 63~2. 73范围内（通常RRT大约2. 68)，从而本发明亦可将该杂质Iz称为 RRT2. 68 杂质、杂质 RRT2. 68、或 RRT2. 68。
[0049] 因此，在本发明下文中，提及RRT0. 89杂质时，均指在【HPLC-A】系统中，相对于式I 化合物的保留时间而言，相对保留时间在〇. 86~0. 92范围内出现杂质，该杂质为杂质Ix ; 同样地，在本发明中，提及RRTL 14杂质时，均指在【HPLC-B】系统中，相对于式I化合物的 保留时间而言，相对保留时间在1. 10~1. 18范围内出现杂质，该杂质为杂质Iy ;同样地， 在本发明中，提及RRT2. 68杂质时，均指在【HPLC-B】系统中，相对于式I化合物的保留时间 而言，相对保留时间在2. 63~2. 73范围内出现杂质，该杂质为杂质Iz。
[0050] 相对保留时间的含义在本领域是公知的，例如，杂质Ix的相对保留时间（缩写为 RRT)是指在色谱图中，杂质Ix色谱峰的保留时间除以式I化合物色谱峰的保留时间所得的 值，即Ix的RRT =杂质Ix保留时间+式I化合物保留时间，而格隆溴铵本身的相对保留 时间为1或者1. 〇〇,这种算法是本领域技术人员公知的。
[0051] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含格隆溴铵的本发明原料药中，Ix杂 质相对于格隆溴铵而言含量低于0.5% (例如低于0.4%，例如低于0.3%)。该含量可以 使用高效液相色谱法测定并计算，特别是使用【HPLC-A】测定并计算。
[0052] 在本发明中，【HPLC-A】的测定方法如下：
[0053] ⑴溶液：
[0054] 缓冲溶液：2. 8g/L的磷酸二氢钠水溶液，用10 %氢氧化钠溶液调节至pH值 6. 50±0. 05 ;
[0055] 流动相：甲醇：乙腈：缓冲溶液体积比50:10:40的混合液；
[0056] 系统适用性溶液：用流动相配制的溶液，其中含赤型异构体对照品和格隆溴铵对 照品的浓度分别为40 y g/mL ;
[0057] 标准溶液A :精密称取格隆溴铵对照品约50mg，置于100mL量瓶中，用流动相溶解 并稀释至刻度，摇匀，制成浓度约为500 y g/mL的标准溶液A ;
[0058][本领域技术人员公知，上述称取格隆溴铵对照品"约50mg"，在实际操作上是需 要用"约"来修饰的，原因在于精密称量固体物料时，例如使用万分之一天平，通常难以直接 称得50.0 Omg，而是常常会有所偏离，例如偏离此数值±2%，例如精密称量到50. 40mg，则 偏离0. 8%，但这种偏离使得后面的浓度继续偏离并延续到最终的数值计算中，而在最终的 数值计算中考虑此称量偏离，因而最终该偏离理论上不会引起计算误差，从而此处"约"的 表述是允许的，这也是各种版本的中国药典中在进行精密称量时通常都是称取"约"某量的 物料。另外，在一个实施方案中，本发明涉及的用于修饰一个数值的"约"被定义为允许偏 离其修饰的数值的±2%，例如上述"精密称取格隆溴铵对照品约50mg"亦可表示为"精密 称取格隆溴铵对照品50mg±lmg"或者其它类似表述。本发明其它类似表述语境中亦有类 似含义]
[0059] 标准溶液B:精密量取Iml的以上标准溶液A，置于100mL量瓶中，用流动相稀释至 刻度，摇匀，制成浓度约为5yg/mL的标准溶液B;
[0060] 供试品溶液：精密称取含格隆溴铵约为50mg的供试品，置于100mL量瓶中，用流 动相溶解并稀释至刻度，摇匀，必要时过滤，制成含格隆溴铵浓度约为500 y g/mL的供试品 溶液（其中所述供试品可以是包含格隆溴铵的各种样品，例如可以是格隆溴铵粗品、原料 药、精制品以及由它们制成的制剂，根据具体测定需要而定，当测定的是制剂时，折算成该 制剂中包含的格隆溴铵适量以便配制成相应浓度一一这些操作技术是本领域技术人员公 知的）；
[0061] (ii)色谱系统：
[0062] 色谱操作照中国药典2010年版二部附录V D所载高效液相色谱法进行，色谱条件 如下：
[0063] 检测器：紫外检测器，检测波长UV222nm;
[0064] 色谱柱：P环糊精键合硅胶柱，填料粒度5 y m，柱内径4. 0mm，柱长25cm;[注：上 述P环糊精键合硅胶柱的填料是一种P环糊精键合多孔硅胶，此类色谱柱可容易地从市 场上购得，例如可以是购自Merck KGaA公司的Chiradex品牌产品，可以是购自YMC公司的 YMC CHIRAL CD BRP品牌产品，等等。下文具体试验中使用该YMC公司产品]
[0065] 柱温：30 cC;
[0066] 流速：lmL/min;
[0067] 进样量：IOyL;
[0068]系统适用性：系统适用性溶液色谱图中赤型异构体与格隆溴铵之间的分离度不低 于1. 2,标准溶液B色谱图中托尾因子不超过2. 0,标准溶液B色谱图中相对标准偏差不超 过6. 0%，通过系统适用性溶液色谱图和标准溶液B确定赤型异构体与格隆溴铵的保留时 间以及二者的相对保留时间；
[0069] (iii)测定：
[0070] 分别将供试品溶液、标准溶液A、标准溶液B注入液相色谱仪进行测定，读取所得 三个色谱图中格隆溴铵的峰面积，以及供试品溶液色谱图中赤型异构体的峰面积（当该色 谱峰存在时），以及它们的保留时间；
[0071] 根据供试品溶液色谱图和标准溶液A色谱图按外标法以峰面积计算供试品溶液 中格隆溴铵的浓度，记为Ci (单位为y g/mL ;众所周知的外标法计算Ci的计算式为：Ci = (供试品溶液色谱图中主峰面积+标准溶液A色谱图中主峰面积）X标准溶液A中格隆溴 铵浓度；单位为yg/mL，此格隆溴铵浓度排除杂质、辅料、水分等干扰，对于原料药而言该 浓度可能与配液浓度接近，但是对于杂质和/或水分等较多的粗品以及添加了辅料的药物 组合物例如药物制剂而言，该浓度可以准确地反映溶液中格隆溴铵的浓度）；
[0072] 按下式计算供试品溶液中赤型异构体（当其存在时）的浓度，记为Cx(单位为 y g/mL)：
[0073]
[0074] 按下式计算样品中相对于格隆溴铵而言赤型异构体含量（为百分含量，％):
[0075] 赤型异构体含量（％ ) = (Cx + Ci) X 100%。
[0076] 以上【HPLC-A】中，以格隆溴铵的相对保留时间为1或者为1. 00计，赤型异构体 的相对保留时间在0.86~0.92范围内，下文具体测定结果中均在该范围内，特别是约为 0. 89 〇
[0077] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含格隆溴铵的本发明原料药中，Iy杂 质相对于格隆溴铵而言含量低于〇. 50% (例如低于0. 30%、低于0. 25%、低于0. 20%、低 于0. 15 %、低于0. 13% )，例如Iy杂质含量（相对于格隆溴铵计）在0.003 %~0.500% 范围内（例如在〇. 003 %~0. 400 %范围内、例如在0. 003 %~0. 300 %范围内、例如在 0. 003%~0. 250%范围内、例如在0. 003%~0. 200%范围内、例如在0. 003%~0. 150%范 围内、例如在〇. 003%~0. 130%范围内）。该含量可以使用高效液相色谱法测定并计算，特 别是使用【HPLC-B】测定并计算。
[0078] 根据本发明第一方面的方法，其所制得的包含格隆溴铵的本发明原料药中，Iz杂 质相对于格隆溴铵而言含量低于〇. 50% (例如低于0. 30%、低于0. 25%、低于0. 20%、低 于0. 15 %、低于0. 13% )，例如Iz杂质含量（相对于格隆溴铵计）在0.002 %~0.500% 范围内（例如在〇. 002 %~0. 400 %范围内、例如在0. 002 %~0. 300 %范围内、例如在 0. 002%~0. 250%范围内、例如在0. 002%~0. 200%范围内、例如在0. 002%~0. 150%范 围内、例如在〇. 002%~0. 130%范围内）。该含量可以使用高效液相色谱法测定并计算，特 别是使用【HPLC-B】测定并计算。
[0079] 在本发明中，【HPLC-B】的测定方法如下：
[0080] ⑴溶液：
[0081] 缓冲溶液：将1.0 g的无水硫酸钠和200mg的1-己烧磺酸钠一水合物溶于650mL 水中，向此溶液中加入3. OmL的IN硫酸，混合，即得；
[0082] 稀释溶液：将1.0 g的无水硫酸钠、6. 8g磷酸二氢钾和200mg的1-己烷磺酸钠一 水合物溶于650mL水中，向此溶液中加入3. OmL的IN硫酸、150mL的甲醇和200mL的乙腈， 混合，用磷酸调节PH值为2. 8,即得；
[0083] 溶液A :乙腈：甲醇：缓冲溶液体积比20:15:65的混合液；
[0084] 溶液B :乙腈：甲醇：缓冲溶液体积比50:15:35的混合液；
[0085] 标准溶液A :精密称取格隆溴铵对照品约100mg，置于100mL量瓶中，用稀释溶液溶 解并稀释至刻度，必要时经超声处理以促使溶解，摇匀，制成浓度约为1000yg/mL的溶液， 为标准溶液A ;
[0086] 标准溶液B :分别精密称取杂质Iy对照品和杂质Iz对照品各约15mg，置于100mL 量瓶中，另精密量取15ml的以上标准溶液A置于同一量瓶中，加稀释溶液稀释至刻度， 必要时经超声处理以促使溶解，摇匀，得到含格隆溴铵、杂质Iy、杂质Iz三者浓度均约为 150 y g/mL的溶液，为标准溶液B ;
[0087] 标准溶液C :精密量取Iml的以上标准溶液B置于100mL量瓶中，加稀释溶液稀释 至刻度，摇匀，制成含格隆溴铵、杂质Iy、杂质Iz三者浓度均约为I. 5 y g/mL的溶液，为标准 溶液C ;
[0088] 标准溶液D:精密称取杂质Iy对照品约15mg，置于100mL量瓶中，加稀释溶液稀释 至刻度，必要时经超声处理以促使溶解，摇匀，得到含杂质Iy浓度约为150 y g/mL的溶液， 为标准溶液Dy;另精密称取杂质Iz对照品约15mg，置于100mL量瓶中，加稀释溶液稀释至 刻度，必要时经超声处理以促使溶解，摇匀，得到含杂质Iz浓度约为150 yg/mL的溶液，为 标准溶液Dz ;
[0089] 供试品溶液：精密称取含格隆溴铵约为IOOmg的供试品，置于100mL量瓶中，用稀 释溶液溶解并稀释至刻度，必要时经超声处理以促使溶解，摇匀，必要时过滤，制成含格隆 溴铵浓度约为1000yg/mL的供试品溶液（其中所述供试品可以是包含格隆溴铵的各种样 品，例如可以是格隆溴铵粗品、原料药、精制品以及由它们制成的制剂，根据具体测定需要 而定，当测定的是制剂时，折算成该制剂中包含的格隆溴铵适量以便配制成相应浓度-- 这些操作技术是本领域技术人员公知的）；
[0090] (ii)色谱系统：
[0091] 色谱操作照中国药典2010年版二部附录V D所载高效液相色谱法进行，色谱条件 如下：
[0092] 检测器：紫外检测器，检测波长UV222nm ;
[0093] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱，填料粒度5 ym，柱内径4. 6mm，柱长15cm ; [注：这是一种本领域极为常用的色谱柱]
[0094]梯度洗脱程序：
[0095]
[0096] 柱温：4(TC ;
[0097] 流速：lmL/min;
[0098] 进样量：50yL;
[0099] 系统适用性：标准溶液C色谱图中杂质Iy与格隆溴铵之间的分离度不低于2. 0， 格隆溴铵峰的托尾因子不超过2. 0,各色谱峰的相对标准偏差不超过6. 0% ;通过标准溶液 Dy和标准溶液Dz的色谱图主峰保留时间确定在此色谱条件下杂质Iy和杂质Iz的保留时 间，并通过标准溶液B色谱图确定杂质Iy、杂质Iz、格隆溴铵的保留时间以及三者的相对保 留时间；
[0100] (iii)测定：
[0101] 分别将供试品溶液、标准溶液A、标准溶液C注入液相色谱仪进行测定，读取所得 三个色谱图中格隆溴铵的峰面积，供试品溶液色谱图中杂质Iy和杂质Iz以及其它任选存 在的杂质的峰面积（当这些色谱峰存在时），标准溶液C色谱图中杂质Iy和杂质Iz的峰面 积，以及它们的保留时间；
[0102] 根据供试品溶液色谱图和标准溶液A色谱图按外标法以峰面积计算供试品溶液 中格隆溴铵的浓度，记为Ci (单位为y g/mL ;众所周知的外标法计算Ci的计算式为：Ci = (供试品溶液色谱图中主峰面积+标准溶液A色谱图中主峰面积）X标准溶液A中格隆溴 铵浓度；此格隆溴铵浓度排除杂质、辅料、水分等干扰，对于原料药而言该浓度可能与配液 浓度接近，但是对于杂质和/或水分等较多的粗品以及添加了辅料的药物组合物例如药物 制剂而言，该浓度可以准确地反映溶液中格隆溴铵的浓度）；
[0103] 按下式计算供试品溶液中杂质Iy或杂质Iz的浓度，分别记为Cy或Cz (单位为 y g/mL，当其存在时）：
[0106] 按下