e)为5.7cm2。过滤 器保持件用反渗透水填充并排除气泡。过滤器保持件连接至来自Watson Marlow的多通道 盒式累（型号20抓），其管线没有气泡。盒式累输出为每分钟约5ml。然后经过膜过滤器系列 地累入下列介质，每种4分钟时间：IM NaCiaM肥1，ImM肥1，反渗透水。
[0124] 然后将具有磁力揽拌棒的40ml玻璃烧杯放在过滤器保持件的输出侧下。然后进一 步提供IM化Cl 4min。收集的洗脱液然后通过电位指示的方式滴定。滴定液为5 .OmM氨氧化 钢水溶液。为此，直到pH 7.0的等当量点，确定5mM氨氧化钢水溶液的消耗量。消耗的氨氧化 钢水溶液的定量的量直接与膜上的硫酸系基团的定量的量成比例。从可得的膜的活性表面 和氨氧化钢水溶液的消耗量W及每cm 2的纤维素质量，可计算硫酸化程度，其与硫酸化纤维 素上的硫酸系基团的质量成比例。
[0125] 式；
[01%]硫酸系基团密度：
[0127] 11蓮疆(皿Ol/cm2) = C(NaOH) Xt(NaOH) Xc(NaOH) X 1000/A [012引 其中
[0129] C(NaOH) Wmol/1计的氨氧化钢滴定水溶液的定量的浓度
[0130] WNaOH) Wml计的在等当量点(pH 7)下消耗的滴定液体积
[0131] t(NaOH)滴定液的校正因子
[0132] 1000 从111〇1/1向皿〇1/1111的转化因子
[0133] A Wcm2计的活性过滤器表面
[0134] 并且其中
[0135] M(S03) Wiig/皿〇1计的S03的摩尔质量。
[0136] 式；
[0137] W重量％计的硫酸化程度= (n?酿疆XM(S〇3)/ni；书朦+(n?酿疆XM(S03))) X 100%
[013引 其中
[0139 ] 1??*打孔空白的纤维素 Wiig每cm2计的纤维素质量
[0140] 样品1至5的硫酸化程度的结果总结于表2。
[0141] 实施例6:对溶菌酶的结合能力的测定
[0142] 将活性膜表面为17.6cm2的各膜样品在35ml的IOmM憐酸钟缓冲液化Pi)中，在 pH7.0下约80转每分钟(rpm)下震摇3次5分钟，然后置于溶菌酶在IOmM Kpi、pH7.6中的2mg/ ml溶液35ml中在20至25°C下放置12至18小时。然后将膜样品每次在35ml的IOmM KPi缓冲液 (抑7.0)中漂洗2 X 15分钟。然后将膜样品在20ml的IOmMKPi缓冲液(PH7.0)和IM NaCl水溶 液中震摇。洗脱的蛋白质的量通过测定280nm下的光密度(OD)而确定。
[0143] 样品I至5和Sartobind'KiS对溶菌酶的结合能力的结果总结于表2。
[0144] 实施例7:宿主细胞蛋白质(HCP)的结合
[0145] 为了确定宿主细胞蛋白质的结合，用没有抗体的10倍浓缩的HCP在PBS缓冲液(憐 酸盐缓冲的盐水溶液，pH 7.4)中的溶液，在感染产生剂kon化act producer)的情况中，在 中国仓鼠卵巢细胞系的"假"运行（培养细胞系而没有抗体产生）中制备。HCP溶液在20mM TRIS/肥1缓冲液(pH 7.4)中1:10稀释，并通过添加化Cl将电导率调节至lOmS/cm。1000 ml稀 释的HCP溶液用于加载膜。肥P浓度通过化ISAr酶联免疫吸附试验化ISA切gnus CM105") 的方法根据方法说明测定。宿主细胞蛋白质化CP)的浓度为化g/ml。
[0146] 3层膜层(样品4)固定在膜保持件中。膜保持件中的膜层叠的膜表面积为15cm2,流 入表面为5cm 2,床高度(膜层叠的厚度)为750皿。膜保持件中的膜用20mM TRIS/HC1缓冲液 (抑7.4)漂洗^取代空气，然后连接至来自66化日1*11。日'6的"_^^|(化@6邱1〇的'100"色谱 系统。
[0147] 然后用包含4个步骤的试验程序检查膜或膜层叠的HCP结合。试验程序的4个步骤 说明如下：
[0148] l.用10ml电导率为10mS/cm的20mMTRIS/肥l缓冲液(pH7.4)平衡膜，
[0149] 2.用100mL HCP溶液加载膜，
[0150] 3.用IOml的20mM TRIS/肥1缓冲液(pH 7.4，电导率1〇1115/畑1)洗涂，和
[0151] 4.用IOml的20mM TRIS/肥 1 缓冲液(pH 7.4)中的IM NaCl洗脱。
[0152] 所有步骤在lOml/min的流速下进行。在所有步骤中，吸收在紧接在膜单元后的检 测器在280nm下测定。穿透曲线示于图3。
[。巧引实施例8对小型失活流感病毒的结合能力的测定
[0154] 甲型流感化erto Rico/8/34，HlNl在贴壁MDCK细胞（GMEM培养基）中产生（参考 Y.Genzel等人，Vaccine 22(2004)，2202-2208)。培养之后，培养基经连续的两步过滤步骤 过滤（孔径扣m和0.65皿过滤器深度,GE Water&Process Technologies)，并接着用3mM0-丙 内醋在37°C下化学灭活24小时。灭活后，再次使溶液澄清（0.4扣m膜过滤器，GE Waterfe Process Technologies),并接着经交叉流过滤器（750kDa MWCO,GE Healthcare)浓缩20倍 (参见 B.Ka 化 fuss 等人，Biotechnol. Bioeng.97(l ),2007,73-85)。浓缩的样品在-80 °C 下存 储直至需要使用。
[0K5] 冷冻的病毒分装品（3 X 2ml)在水浴中解冻，混合并在9000g下离屯、IOmin。接着用 结合缓冲液（IOmM his,pH 7.4和50mM NaClH:3稀释上清。
[0156]由此制备的溶液用于测定动态结合能力。所有实验在来自GE Healthcare的" 及k姑?Ewlorer 100"色谱系统上进行。实验所试验的单元由流入表面0.36cm2和床体积 0.14ml的15层膜层组成。平衡用IOmM Tris，50mM化Cl，pH7.4进行。平衡后，26ml病毒溶液 加样在单元上，并连续收集2ml部分。加样时的流速为Iml/min。血凝素化A)活性在不同部分 中定量。加样后，膜单元用平衡缓冲液漂洗直至到达基线，并随后用IOmM化is,2.OM化Cl pH7.4洗脱。也收集洗脱液和漂洗部分，并且也分析其HA活性。
[0157]病毒浓度在连续流部分中测定，并经血凝素试验定量（参见Kalbf USS等人， Biologicals 36(2008)，145-161)。针对所有样品测定对流感病毒的结合能力，并且能力在 10%、25%和50%穿透处计算，即每体积分离材料的结合的病毒量达至起始溶液的病毒浓 度的10%或25%或50%。动态结合能力计算如下：
[0158] Co:起始溶液中的病毒浓度(病毒颗粒/ml =颗粒/ml)
[0159] Vx:达至X%穿透的加样体积(ml)
[0160] Ax:达至X%穿透的连续流中病毒颗粒的数目
[0161] Vb :试验单元的床体积
[0162] 达至X%穿透的动态结合能力(颗粒/ml) = (VxXCo-Ax)Ab
[0163] 样品1至5和Sartobind'i"的结合能力的结果总结在表2中。
[0164] 表2:结果总结
[0166] *在样品5中，由于此膜对流感病毒非常高的结合能力，25%和50%穿透都不能由 实施例8中述及的26ml的病毒溶液加样体积达到。
【主权项】
1. 一种硫酸化纤维素水合物膜，其包括具有从膜的一个主表面向另一个主表面延伸的 孔的交联纤维素水合物基质，其中所述纤维素水合物膜在其内外表面上具有硫酸系配体用 于吸附物质的分离。2. 根据权利要求1所述的硫酸化纤维素水合物膜，其中所述纤维素水合物基质的硫酸 化程度为10重量％以上。3. 根据权利要求1或2所述的硫酸化纤维素水合物膜，其中所述膜的平均孔径为0.5至 5.0μηι之间。4. 根据权利要求1至3任一项所述的硫酸化纤维素水合物膜，其中所述纤维素水合物基 质的交联程度为0.05至0.5。5. -种用于制备根据权利要求1所述的硫酸化纤维素水合物膜的方法，其包括以下步 骤： -提供孔径为〇. 1至20μπι的纤维素水合物膜； -用分子中具有与所述纤维素水合物基质的羟基反应的至少两个官能团的交联剂将所 述纤维素水合物基质交联;和 -将交联纤维素水合物基质硫酸化。6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述交联剂选自由双环氧化合物、二异氰酸酯、表 氯醇、表溴醇、二甲基脲、二甲基乙基脲、二甲基氯硅烷、双(2-羟乙基砜）、二乙烯基砜、亚烷 基二卤化物、羟亚烷基二卤化物和二环氧甘油醚或其混合物组成的组。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其中1，4_丁二醇二环氧甘油醚或乙二醇二环氧甘油 醚用作所述交联剂。8. 根据权利要求5至7任一项所述的方法，其中所述交联剂在交联溶液中的浓度为10至 30重量％。9. 根据权利要求5至8任一项所述的方法，其中所述硫酸化通过将所述交联纤维素水合 物基质与路易斯碱-S03复合物反应而进行。10. 根据权利要求5至9任一项所述的方法，其中所述硫酸化通过与S03-吡啶复合物的反 应进行。11. 根据权利要求10所述的方法，其中所述S〇3-吡啶复合物在硫酸化溶液中的浓度为1 至40重量％。12. 根据权利要求5至11任一项所述的方法，其中所述硫酸化在20至90°C的温度下进 行。13. 根据权利要求1至4任一项所述的硫酸化纤维素水合物膜作为用于纯化病毒或病毒 片段的吸附膜的用途。14. 根据权利要求13所述的用途，其用于纯化分子量大于107Da的病毒。15. 根据权利要求13或14所述的用途，其用于纯化流感病毒。
【专利摘要】本发明涉及硫酸化纤维素水合物膜、其制备方法，以及所述膜作为病毒纯化处理用吸附膜的用途。
【IPC分类】C12N7/00, B01D71/20
【公开号】CN105658313
【申请号】
【发明人】L·维兰, H-H·霍勒, C·布鲁姆
【申请人】德国赛多利斯生物技术公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年9月11日