直至交联介质的沸点，其中优选从fTC至 约85 °C范围内的溫度。特别优选20°C至40°C的溫度。
[0074] 交联持续时间通常为几分钟至几天，其中优选在15至30°C下12小时至7天的交联 持续时间。特别优选1至3天的交联持续时间。在用于制备根据本发明膜的根据本发明方法 的优选实施方案中，交联溶液中交联剂的浓度在10至30重量％之间。
[0075] 如上所述，根据本发明的硫酸化纤维素水合物膜的交联程度为0.05 W上，优选 0.07W上，并特别优选0.1 W上。交联程度的上限优选0.5,更优选0.4,并特别优选0.3。
[0076] 更有利地，根据本发明的膜由于交联而具有更高的化学稳定性，并因此在后续的 硫酸化过程中耐受更高的反应溫度(上至90°C)。
[0077] 硫酸化：
[0078] 硫酸化通过将交联的纤维素水合物膜与路易斯碱-S化复合物反应而进行。反应可 如下进行:在胺的存在下W氯横酸进行，或通过与S〇3-酷胺复合物反应(其中二甲基甲酯胺 可优选用作酷胺）来进行，或通过与S〇3-胺复合物反应(其中化晚或=甲胺可优选用作胺） 来进行。S〇3-化晚复合物特别优选用于反应。
[0079] 硫酸化溶液中S〇3-化晚复合物的浓度通常为1至40重量％，特别优选在10至30重 量％之间的浓度。
[0080] 通常，质子惰性的极性溶剂，例如二甲基甲酯胺(DMF)、二甲基亚讽(DMS0)、二甲基 乙酷胺(DMAc)、N-甲基-2-化咯烧酬或2-化咯烧酬等可用作与S〇3-胺复合物反应用的溶剂。 特别优选2-化咯烧酬。
[0081 ] 反应持续时间在30min至24小时之间，特别优选1至4小时之间的反应持续时间。
[0082] 反应溫度在20至90°C之间，特别优选70至90°C的反应溫度。
【附图说明】
[0083] 本发明通过下列实施例和图1至3的方式详细说明。示出
[0084] 图1交联程度对于根据本发明的膜的硫酸化程度、对于RO水的透过性和对于溶菌 酶的结合能力的影响。
[0085] 图2对流感病毒和溶菌酶的动态结合能力，和
[0086] 图3来自现有技术的硫酸化多糖凝胶和本发明硫酸化纤维素膜用HCP溶液（"宿主 细胞蛋白"溶液)加载的穿透曲线。
【具体实施方式】
[0087] 工作例
[0088] 将5种不同的膜功能化，W便说明交联的影响。将两种不同的硫酸化方法施于孔径 相同的交联和非交联(比较例)纤维素水合物膜(样品1至4)。
[0089] 进一步制备根据实施例1交联并根据实施例2硫酸化的样品（样品5)。此样品与样 品1至4的不同之处在于平均孔径为1.2WI1的更窄的起始膜用于硫酸化。所有膜样品根据实 施例5至8表征。结果总结于表2。Sartobincfs样品为具有横酸配体的纤维素水合物膜。
[0090] 图1示出交联程度的增加导致硫酸化程度的增加，但也导致RO水的流速的增加。此 夕h根据本发明交联的硫酸化膜具有相比于污染物更高的对流感病毒的选择性，因为其实 验性地示出对例如溶菌酶等小的带负电蛋白质显著更低的动态结合能力。图1中的硫酸化 程度W重量％示出。表1包含制备图1的膜用的交联溶液的组成的详细信息。
[0091] 图2示出，由于根据本发明的样品2、4和5的膜具有对流感病毒更高的动态结合能 力，其结合性质明显比选作比较例的样品1和3的膜更好。样品5的膜对流感病毒的动态结合 能力更高，是样品1和3的10倍W上。此外，在样品2、4和5的膜中，对例如溶菌酶等小的带正 电的蛋白质污染物的结合能力，仅仅是非交联样品1和3W及具有阳离子交换横酸基作为配 体的"Sartobiiid?S"膜的1/3。根据本发明的样品5的膜因此在所有研究的样品中具有对流 感病毒结合的最高的选择性。
[0092] 图2中的描述符号巧+12"表示"X 1 〇1》'。
[0093] 图3展示的WHCP溶液(宿主细胞蛋白质溶液)的穿透曲线示出，与常规的硫酸化多 糖凝胶不同，样品4的硫酸化膜实际上不结合例如宿主细胞蛋白质化CP)等污染物。在此情 况下，来自JNC Co巧oration的Cellufine?Sulfate和来自GE Healthcare的C.ap的?DeVi;rS 用于比较。在根据本发明的样品4的膜中，发生宿主细胞蛋白化CP)的立即穿透，运证明此膜 不结合任何HCP。在作为比较例的硫酸化凝胶中，原始使用的HCP溶液的UV信号仅在100mL柱 体积kolumn volume，CV[ml] = Wml计的柱体积)后再次获得，运证明硫酸化凝胶结合运些 污染物至可观的程度。上文记载的根据本发明的膜的性质对病毒的纯化有重要的优点，因 为例如HCP等污染物不能结合至膜材料，并因此病毒洗脱后在洗脱液中没有发现污染物。为 此，可省略进一步的污染物除去步骤，并且显著降低纯化过程的总成本。同样显然的是，根 据本发明的膜中更高的硫酸系配体密度W期望的方式在污染物结合上没有负面作用，仅选 择性地提高对流感病毒的结合能力。
[0094] 实施例1:纤维素微量过滤器膜的交联
[00M]交联反应在20至25°C下进行。将10%氨氧化钢水溶液添加至预充填量（Wg计）的 反渗透水并揽拌。然后添加1,4-下二醇二环氧甘油酸(Sigma-Aldrich,化t.No. :220892)并 揽拌至形成均匀溶液。交联程度可通过交联溶液中1,4-下二醇二环氧甘油酸的浓度控制。 此处制备的交联溶液中反渗透水、氨氧化钢水溶液和1,4-下二醇二环氧甘油酸(BUDGE)各 自的量和根据本发明的膜所得的交联程度总结于表1。
[0096]表1:交联溶液的组分和所得的交联程度
[009引将来自Sartorius Stedim Biotech GmbH的干燥纤维素微量过滤器膜（型号 10142V)的DIN A4片用交联溶液完全湿润，然后在气密性聚乙締袋中存储7天。交联反应结 束后，微量过滤器膜用流动的反渗透水漂洗lOmin，然后在对流烘箱中在80°C下干燥10至12 分钟。
[0099]为确定如上文定义的交联程度，进行下列工序:型号10142V的非交联纤维素膜在 Sartorius水分分析仪天平（型号MAlOO)中于110 °C下干燥5min，并测定其重量iM。然后，膜 用交联溶液湿润。将没有用交联剂处理的另外的空白样品称重，W确定归结于可浸出组分 的重量损失。7天的交联时间后，用流动的RO水漂洗膜10分钟，然后在对流烘箱中在80°C下 预干燥IOmin，并最后-作为起始膜-在水分分析仪天平中干燥5min，并确定mv。通过未经交 联剂处理的空白样品的方式，确定可浸出组分的质量me。定义的值所需的质量的百分增长 A M如下文产生：
[0100] AM=100%*((nw-mA-?)/mA-?))，
[0101] 其中
[0102] mv交联膜的质量
[0103] IIlA非交联膜的质量
[0104] HlB空白样品可浸出组分的质量。
[0…引实施例2:用2-化咯烧酬和化晚-立氧化硫复合物来硫酸化
[0106] 将2g化晚-S氧化硫复合物（Sigma-Al化ich，Cat.No.84737-500g)在揽拌下添加 至Sg 2-化咯烧酬。反应容器密封。然后混合物控溫在70°C下，于是化晚氧化硫复合物溶 解，并形成髓色硫酸化溶液。
[0107] 向加热至70°C、具有研磨玻璃盖的80ml称重瓶的基座中，用移液管加入3.Sg加热 至7(TC的新制备的硫酸化溶液。将非交联膜(比较例，型号10142V的实施例1的起始膜)和根 据实施例1交联的膜的圆形干燥纤维素微量过滤器膜盘(直径70mm)依次置于硫酸化溶液 中；在此情况下它们自发湿润。然后立即密封反应容器。
[0108] 然后在对流干燥楓中70°C下将反应容器存储4小时。随后用流动的反渗透水漂洗 硫酸化纤维素微量过滤器膜IOmin，在IM化Cl溶液中W1 OOg震摇5min，然后在流动的反渗 透水下漂洗5min。然后在30重量％甘油和70重量％水的100g溶液中将膜震摇5min，并随后 在80 °C下干燥IOmin。
[0…9] 实施例3:用化晚和氯横酸来硫酸化
[0110] R比晚（Sigma-Ald;rich,Cat.No.270970-lL)和氯横酸（Sigma-Ald;rich, 化t.No.571024-100G)在使用前冷却至-18°C。伴随剧烈揽拌，经压力平衡滴加漏斗和干燥 管将60ml氯横酸在15min内逐滴添加至1000 ml化晚中，其中溫度一定不能超过5°C ;此处析 出白色固体。
[0111] 然后密封混合物，并在水浴中揽拌下加热至65°C，直至固体完全溶解。然后将由此 获得的硫酸化溶液在1小时内冷却至40°C。
[0112] 宽度为3.3cm、长度为21cm的非交联的膜条(来自实施例1的比较例）和来自实施例 2的膜条共计18条，W粗糖PP织物缠绕并转移至500ml聚丙締旋盖罐。控溫至40°C的硫酸化 溶液转移至该旋盖罐。密封旋盖罐。
[0113] 在40°C下震摇反应容器20小时。然后将膜过滤器条漂洗并如下文浸溃：
[0114]-流动的反渗透水lOmin，
[0115]-用1000 ml的IM NaCl震摇IOmin，
[0116]-流动的反渗透水IOmin，
[0117]-在30重量％甘油和70重量％水的溶液中lOmin。
[011引然后将其在80°C下干燥12小时W上。
[0119] 实施例4:微量过滤器膜的渗透性测定
[0120] 从根据实施例3的硫酸化纤维素微量过滤器膜中打孔出47mm盘。用反渗透水将之 湿润，并在流动的反渗透水下漂洗5min。打孔空白包含在Sador ius型号16249压力过滤器 保持件中。测定在20至25°C和0.化ar正压下进行。测定100g介质流经膜过滤器所消耗的时 间。由此确定的流动单位表示为ml/(cm 2 ? min ? bar)。反渗透水和抑7的IOmM憐酸钟缓冲液 都用作介质。
[0121]流动测定后，盘可用于进一步的研究。
[01。] 实施例5:通过滴定定量测定硫酸化程度
[0123] 用圆形打孔器从硫酸化纤维素微量过滤器膜打孔出30mm盘。30mm打孔空白包含在 死体积优化的过滤器保持件中。活性过滤器表面(acti ve f i 1 ter surfac