硫酸化纤维素水合物膜、其制备方法和该膜作为病毒纯化用吸附膜的用图
【技术领域】
[0001 ] 本发明设及硫酸化纤维素水合物膜（sulfated cellulose membrane)、其制备方 法和该膜作为病毒纯化用吸附膜的用途。
【背景技术】
[0002] 流感(流感病毒)是由流感病毒引发的上下呼吸道的高度传染性急性感染。流感作 为世界性流行病而发生，特别是在冬季的月份，然而个别的病毒也可引发大流行。当前控制 流感爆发的策略是基于预防性疫苗结合例如神经氨酸酶抑制剂等抗病毒治疗。大部分季节 性人类流感疫苗是失活S价裂解病毒粒体(trivalent split virion)疫苗。运些由病毒抗 原，S种不同流感病毒亚型的包膜糖蛋白血凝素化A)和神经氨酸酶化A)组成。各种抗原用 去污剂(例如CTAB(十六烷基S甲基漠化锭)或吐溫20(聚山梨醇醋20))通过膜增溶而从纯 化的病毒颗粒获得。
[0003] 在传统的生产方法中，流感病毒在溫育的鸡蛋中生产。除了此方法的有限扩展性 和与之相关联的问题W外，在鸡蛋中生产个别大流行流感病毒(例如H5N1)有系统性困难而 难W满足全球市场增长的需求。最后，对鸡蛋白质的变态反应问题也使得在生物反应器中 使用哺乳动物细胞的生产方法建立了若干年。在细胞培养中培养病毒之后，需要从污染物 (例如宿主细胞蛋白质、DNA)中分离病毒，W便病毒可进一步W其纯化形式使用。此外，从非 感染性分子或颗粒分离感染性物质是有利的。在生物药物生产过程中，脱氧核糖核酸(DNA) 和从宿主细胞培养物中产生的其它蛋白质作为副产物出现。运通常当作污染物，并且必须 在处理时从终产物中除去。在病毒的生产中，宿主细胞或病毒自身的DNA片段也被释放，运 些必须被除去。
[0004] 通过色谱纯化在固相上吸附病毒，在病毒纯化特别是在处理规模中有重要意义。 其特征在于分子结合至吸附器材料(离子交换器、疏水或亲水吸附剂），且之后可在后续步 骤中W纯化形式洗脱。在此情况中，吸附过程可逆地进行是重要的，W便获得高产率。可进 行简单富集或者分离成两种W上的目标物质，其中后一种情况可选择性地影响吸附或解吸 或二者。用于此目标的色谱介质的主要缺点是其相对低的选择性，和溶液中存在的污染物 (DNA片段和宿主细胞蛋白质）也可结合至吸附器材料，W至于需要长的处理展开时间，W便 确定最优结合和洗脱条件(pH、离子强度和缓冲系统的选择）。
[0005] 亲和色谱提供增加的选择性。从现有技术可知硫酸化纤维素基质对流感病毒和肝 素结合蛋白的选择性增加。
[0006] EP0053473A1公开了具有肝素样效果的纤维素硫酸盐Cellulose sulfate salt) 供用作抗凝剂。为了充分的高抗凝效果，与生理条件下的所需高长期稳定性一起，纤维素的 硫酸化程度(在化喃糖单元的C2、C3和C6原子上OH基团被硫酸系基团（SUl化te group)取代 的程度)在0.8至2.6之间。纤维素硫酸盐可通过=种不同方法获得:通过在胺的存在下与氯 横酸反应，通过与例如二甲基甲酯胺可用作酷胺的S〇3-酷胺复合物反应，或通过与例如化 晚可用作胺的S〇3-酷胺复合物反应。在述及的后一变型中，纤维素与S〇3-化晚复合物在室溫 下反应30至35分钟，并随后WNaOH中和。
[0007] EP1698641A1公开了纤维素硫酸盐作为治疗活性成分用于例如特应性湿疹等皮肤 疾病。纤维素硫酸盐的特征在于对透明质酸酶的抑制效果，并具有基于纤维素硫酸盐总重 量为6.5至19.0重量％的硫酸系基(Siil化te)含量。在制备中，结晶纤维素首先在例如化晚、 二甲基亚讽或二甲基甲酯胺等溶剂中预溶胀。所得的混合物添加至选自氯横酸、赃晚-硫酸 复合物、S化-化晚复合物、S化甲胺复合物或硫酸酢-二甲基甲酯胺复合物的组的硫酸化 试剂，其中优选较后述及的复合物。
[000引上文述及的两篇文献EP0053473A1和EP1698641A1都没有公开任何用于纯化病毒 的色谱分离材料。此类分离材料作为凝胶可商购，并用于上述分子和病毒的纯化。用于纯化 病毒的运些介质的使用常常提供对病毒的低结合能力和低病毒收率。病毒的大小可达 5(K)nm，并因此孔径在30至4(K)nm范围的微粒色谱凝胶不太合适。通常，那么病毒仅可结合至 颗粒的外表面，运解释了低结合能力。
[0009] 由纤维素、葡聚糖或琼脂糖组成的色谱凝胶的硫酸化W及用于纯化流感病毒的运 些硫酸化凝胶的使用是现有技术中已知的。通过实例的方式，RD298025A公开了可通过在65 至70°C下 W氯横酸-化晚复合物将乂elIulof ine GH-25"、"Sepharose 化-6B"或"Sephadex G-50"硫酸化，接着W化OH中和，并用憐酸盐缓冲盐溶液洗涂而制备的亲和色谱凝胶。此凝 胶适合用于纯化例如乙肝抗原，HIV-I和HIV-3病毒，SV40-T抗原，凝血因子7、8、9和11，核酸 聚合酶，干扰素或溶菌酶等蛋白质。
[0010] EP0171086A2记述了基于琼脂糖、葡聚糖或纤维素，用化晚中的氯横酸或无水硫酸 在65至70°C下硫酸化（部分）结晶多糖凝胶的方法。多糖凝胶的硫酸化程度通常在0.1至 40%之间，其中纤维素凝胶的硫酸化程度特别地在0.1至5%之间。源于鸡胚细胞培养物的 流感病毒或抗原可用硫酸化纤维素凝胶纯化。
[0011] W02008/039136A1公开了多孔多糖基质，优选来自琼脂糖，SOOkDa葡聚糖"延伸剂 (extender)"分子与之结合，其中硫酸系基团依次结合至葡聚糖分子作为配体，用于纯化病 毒。基质用于从DNA污染物分离病毒，优选流感病毒，其中病毒最初吸附在基质上，并随后W 合适的缓冲液洗脱。为制备前述基质，在硫酸化"延伸剂"分子固定在多糖基质上之前，硫酸 系配体首先结合至"延伸剂"分子。
[0012] EP0171771A2公开了从EP0171086A2中得知的硫酸化纤维素凝胶用于从鸡胚细胞 培养物纯化狂犬病病毒的用途。
[0013] EP0173268A2公开了从EP0171086A2中得知的硫酸化纤维素凝胶用于纯化从哺乳 动物细胞培养裂解物获得的、作为HSV-I和HSV-2型单纯瘤疹病毒成分的糖蛋白gA和gB的用 途。糖蛋白gA和浊在阴离子或非离子表面活性剂的存在下纯化。
[0014] EP0171765A2公开了纯化日本脑炎病毒用于疫苗生产的方法，其中使用了从 EPO171086A2中得知的硫酸化纤维素凝胶。
[0015] 所有前述文件公开了由微粒多孔凝胶颗粒构成的色谱分离介质。为此，截留分子 量(molecular wei曲t cut-off ,MWCO)小于10化曰的多糖凝胶用作硫酸化反应用的基材。病 毒，例如R.W.H Ruigrok等人在J.Gen.Virol. (1984) ,65,799-802中记述的直径大于IOOnm 且分子量(MW)大于108化的流感病毒，仅可有限程度地穿透记述的多孔分离材料的孔，此情 况下仅可利用运些分离材料的部分结合能力。
[0016] 与微粒吸附剂相反，吸附膜具有对病毒完全可接近的实质上更大的孔。此外，它们 提供通过利用两种主要表面之间的液压差而W介质强行灌注的可能性，由此获得可在高流 量下起效快得多的对流迁移，而不是在浓度梯度的方向上吸附剂向吸附剂内部的纯扩散迁 移。由此可避免微粒吸附剂另外的固有缺点，即由下列事实构成的所谓的"扩散限制"：当吸 附剂粒径增加且吸附剂的摩尔质量增加时，建立吸附平衡所需的时间显著增加，运转化为 动力学的劣化。因此，在例如流感病毒的纯化中，用色谱凝胶通常仅获得低流速。
[0017] 基于纤维素的硫酸化膜吸附器已通过硫酸化纤维素水合物膜成功地生产，其中硫 酸化通常通过在适合反应的溶剂中纤维素膜与路易斯碱-S化复合物的反应而发生。与常规 的硫酸化多糖凝胶相比，硫酸化膜吸附器具有下列优点：
[0018] -与微粒分离材料中的扩散"流"相对的对流流动 [0019]-可能更高的流速
[0020]-对配体更好的可接近性和对病毒更高的结合能力
[0021 ]-更简单的扩展性，即，从低体积膜吸附器增加规模至大体积膜吸附器。
[0022] 由于能力是配体密度和可得的结合表面的函数，其通常通过减少膜孔径而增加， 但运对于流动和堵塞特性有负面影响。
[0023] US5,667,684公开了用于从血浆除去HIV病毒的微孔膜，其由例如聚丙締、聚乙締 或聚偏二氣乙締等疏水基材构成，其上接枝了丙締酸烷氧基烷基醋、丙締酸缩水甘油醋或 丙締酷胺的链。硫酸化纤维素通过共价结合固定在此中间接枝层上，其中例如硫酸化纤维 素的游离OH基团与例如接枝链的重复单元的环氧基等官能团反应。HIV病毒主要通过硫酸 化纤维素单元除去。
[0024] US8，173,021B2公开了硫酸化程度(横酷基含量)在0.5至15%之间的硫酸化、非交 联纤维素膜的制备方法，其中纤维素膜与氯横酸-化晚复合物在40°C W下反应。氯横酸-化 晚复合物通过在最高(TC下将氯横酸添加至化晚，接着在60°C下反应并冷却至最高40°C而 制备。可从非交联的再生纤维素膜(例如来自Whatman的RC-55膜)制备的硫酸化纤维素膜在 亲和色谱中使用，亲和色谱用于纯化含蛋白质病毒片段或用于纯化完整病毒颗粒，其后续 用于流感疫苗的生产。
[0025] L.Opitz等人，Biotechnology and Bioengineering,103(6) ,2009,1144-1154,公 开了通过将强化、非交联的纤维素膜与氯横酸在化晚中的溶液在37°C下反应12小时而制备 硫酸化纤维素膜。1化g硫/每g干燥膜下的硫酸化纤维素膜的硫含量，显著低于微粒吸附剂 CeUufine'K SulfateU 700iig硫/每g干燥膜）中的硫含量。硫化纤维素膜用于纯化S种流感 株，即H1NUH3N2和"B/Malaysia/2506/20〇r病毒，其中例如双链DNA或细胞成分等不期望 的污染物从生产病毒用的细胞培养液中有效地被除去。在纯化用的缓冲液中，当化Cl浓度 增加时（150nM对50mM)，膜对病毒的吸附能力降低。与例如Sartobiiid'" S75或SanobincT C75等阳离子交换膜相比，硫化纤维素膜使得双链DNA的耗减提高，并允许比基于 Cellufine? Sulfate色谱柱更高的病毒收率。
[00%] US2012/0171750A1研究了反应溫度对从化itz等人的上述文章中得知的硫酸化纤 维素基质的制备中纤维素基