质的硫酸化程度、对MVA病毒的吸附能力、和纯化MVA病毒制剂 被来自细胞培养液的DNA污染的影响。硫酸化中的反应溫度增加时（35、40或45°C )，纤维素 基质的硫酸化程度从基于纤维素聚合物主链重量的5.3重量％增至13重量％，而纯化的病 毒制剂中DNA分数从7.4 %增至17 %，W及纯化MVA病毒的收率从66 %增至80 %。通过硫酸化 纤维素基质的手段纯化病毒制剂可与使用具有苯基、下基或己基配体的色谱基质的疏水相 互作用色谱的附加步骤组合。
[0027] 使用从US8，173,021B2已知的方法，尽管使用相对微细的膜(来自怖atman的RC-5 5 膜，孔径0.4扣m)也不能获得大于15%的硫酸化程度。选择的孔径也不利于结合直径超过 IOOnm的病毒，因为在病毒吸附时可发生流动损失和膜的堵塞。
【发明内容】
[0028] 因此，本发明的目标是提供病毒纯化，例如流感病毒纯化用的膜，该膜一方面具有 对欲分离的目标化合物的高选择性，另一方面使得能在高流速下将例如双链DNA或细胞成 分等不期望的污染物从病毒生产用的细胞培养液中有效除去。
[0029] 此目标通过权利要求中表征的主题实现。
[0030] 具体地，本发明提供硫酸化纤维素水合物膜，其包含具有从膜的一个主表面向另 一个主表面延伸的孔的交联纤维素水合物基质，其中纤维素水合物膜在其内外表面上具有 硫酸系配体用于吸附物质（adso巧tive subs1:ance)的分离。
[0031] 根据本发明，硫酸化纤维素水合物膜为吸附膜。吸附膜是指具有从一侧穿透至另 一侧的孔的片状吸附剂。吸附剂为多孔固体，其可经称作配体的表面官能团而接受与流体 的特定组分的选择性结合。目标物质和/或污染物是指根据本发明的吸附物(adsorbate)， 其也可采取两种或更多种不同物质的形式。吸附物可为单独分子、缔合物(associate)或颗 粒，在目标物质的情况下优选病毒。
[0032] 根据本发明，纤维素水合物基质的交联在后续处理步骤的硫酸化之前进行。惊讶 地发现欲硫酸化的纤维素水合物膜的预先交联导致对反渗透水(RO水)的透过性增加，导致 硫酸系配体密度增加，导致结合能力增长，并导致对欲分离的目标化合物(特别是对流感病 毒）的结合选择性增强，其中运些有利效果不能通过使用在硫酸化之前没有交联的硫酸化 纤维素膜而获得。与US8，173,021B2和US2012/0171750A1相反，通过交联的纤维素膜而非现 有技术获得的膜的硫酸化，出乎意料地可获得显著更高的硫酸系配体密度。
[0033] 根据本发明的硫酸系配体密度通过硫酸化程度确定，其中根据本发明的硫酸化纤 维素水合物膜的优选实施方案，纤维素水合物基质的硫酸化程度为10重量％ ^上，更优选 15重量％ ^上，并特别优选超过20重量％，其导致有利于病毒生产的选择性提高。根据本发 明，硫酸化程度理解为表示硫酸化纤维素水合物基质上的硫酸系基团的质量比。硫酸化程 度通过滴定而定量测定，其中可例如用氨氧化钢水溶液确定膜上的硫酸系基团的定量的 量。
[0034] 根据本发明，硫酸化程度用下式确定：
[0035] W重量％计的硫酸化程度=(n厕!疆XM(S03)/(聊朦+(n?m强XM(S03))) X 100%
[0036] 其中
[0037] 賴臟=每cm2膜中Wyg计的纤维素的质量
[0038] 和通过下式的方式确定的硫酸系基团密度naass:
[0039] 硫酸系基团密度:naai靈(皿ol/cm2) = c(化OH) Xt(化OH) XWrfeOH) X1000 /A
[0040] 其中
[0041 ] C (NaOH) Wmol/1计的氨氧化钢滴定水溶液的定量浓度
[0042] WNaOH)队ill计的在等当点(pH 7)下消耗的滴定液体积
[0043] t(NaOH)滴定液的校正系数
[0044] 1000 从mo Vl向皿O Vl的转换系数
[0045] A Wcm2计的活性滤器表面
[0046] 和其中
[0047] M(S03) Wiig/皿 〇1 计的 S03 摩尔质量。
[0048] 与非交联纤维素膜的硫酸化相比，硫酸系配体密度可出乎意料地增加，通过根据 本发明的纤维素膜的交联的上至30的系数，相比于来自现有技术的比较例(表2中的样品1 和3)。运甚至用平均孔径超过0.45WI1的纤维素膜也是可能的。
[0049] 纤维素水合物膜预先交联的另外的出乎意料的结果是与之相连的透过性的增加， 和对于例如宿主细胞蛋白质等小蛋白质或污染物的结合能力的降低，尽管硫酸系配体密度 增加，运导致有利于病毒生产的增强的选择性。
[0050] 如下文所述，根据本发明的膜的制备方法可按两步进行:将膜交联和将膜硫酸化。
[0051] 交联程度、孔径、和作为结果的膜的透过性、和用于进一步硫酸化反应的径基的可 接近性可通过交联剂的类型、交联剂的浓度、任选使用的交联催化剂的浓度、如果适当的交 联持续时间、惰性有机溶剂的类型和浓度、和/或交联溫度来控制。
[0052] 根据本发明的硫酸化纤维素水合物膜的优选实施方案，交联的程度在0.05至0.5 之间，其中选择通过与双官能交联剂反应的纤维素的葡糖酢单元的平均取代程度作为交联 程度(DC)的量度。在此情况下，根据本发明的交联程度，如W095/32793A1中记载的，定义为：
[0053] DC = 3.24X AM/Mv [0054] 其中
[0055] DC:根据本发明的膜的交联程度
[0056] A M:通过起始膜的初始质量的W %计的交联，根据本发明的膜的质量增加
[0057] Mv:交联剂的摩尔质量。
[0058] 从双官能交联剂开始，并假设它们各自结合至两个纤维素单体单元，则至多=个 交联剂分子可与两个纤维素单体单元反应。运具有324g/mol的组合摩尔质量。DC的理论最 大可能值为至多3,归因于纤维素单体单元的=个可交联径基。
[0059] 根据本发明，硫酸化纤维素水合物膜适合用于吸附物质的分离，特别是用于病毒 的有效纯化。特别地，W下是可能的：如果选择根据本发明的硫酸化纤维素水合物膜的截留 分子量，使得目标物质不阻塞膜表面，由此可维持高流速。取决于所需的目标物质，可设定 截留分子量，使得目标物质吸附在硫酸化纤维素水合物膜中，并且随后可从其洗脱。根据本 发明的膜的平均孔径优选在0.5至5. Owii之间，特别优选1.0至3. Owii之间。
[0060] 起始胺：
[0061 ] 平均孔径为0.1至20皿，优选0.5至15皿，更优选1至10皿，在根据本发明的方法中 用作起始膜的纤维素水合物膜，通过从例如在L. J. Zeman等人，"Microf i Itration and ultrafiltration principles and applications"，Marcel Dekkerl996, ('Part I"， "Chapter 3. r、DE10326741A巧邮E3447625A1中记载的技术领域中获知的通常制备方法来 制备。为了确定平均孔径，进行"毛细管流气孔测量法山日目111日巧flow porome化y)试验"。 详细信息可见于乂apillaiT Flow Porometer 6.0",CAPWIN Software SystemJorous Materials Inc.的操作指南。
[0062] 优选根据本发明，已任选地受到下文记载的预处理的纤维素醋膜W合适的皂化介 质皂化，在此情况下形成纤维素水合物膜。取决于预处理介质的类型，在皂化步骤中纤维素 醋膜可按干燥或湿润使用。
[0063] 纤维素醋膜可基于单醋酸纤维素、二醋酸纤维素、=醋酸纤维素、丙酸纤维素、下 酸纤维素和乙酷下酸纤维素，或其它合适的纤维素醋或硝酸纤维素、甲基纤维素或乙基纤 维素或其混合物，其中醋酸纤维素系为优选的，特别是二醋酸纤维素。在此情况下纤维素醋 膜在皂化步骤前可在合适的介质中预处理，其中预处理介质包含对纤维素醋有溶解或软化 效果的一种或多种添加剂。合适的添加剂尤其是酸，特别是簇酸，例如醋酸，和用于纤维素 醋的水溶性软化剂，例如甘油二乙酸醋、甘油S乙酸醋和环下讽。
[0064] 皂化介质优选包含碱性化合物，优选碱金属氨氧化物。特别优选使用氨氧化钢、氨 氧化钟或氨氧化裡的水溶液。也可使用碱金属氨氧化物和其它碱性化合物例如碳酸钢、碳 酸钟、碳酸飽等碱金属碳酸盐，碳酸氨钢和/或S聚憐酸钢(sodium triphosphate)、S聚憐 酸钟、娃酸钢和娃酸钟等的混合物。
[0065] 所得的纤维素水合物膜可具有任意合适的厚度。膜厚度优选在50至500WI1之间的 范围，更优选在100至300WI1之间的范围。获得的纤维素水合物膜可成形为片状膜或圆筒。圆 筒膜是指中空纤维膜、毛细管膜或管状膜。
[0066] 交联；
[0067] 交联剂分子中有至少两个官能团，其与纤维素膜的径基反应，并由此实现纤维素 膜的交联。例如，纤维素膜的交联通过可对纤维素聚合物链的径基反应的具有至少两个官 能团的前述交联剂，经两条纤维素聚合物链的（分子间)连接或经纤维素聚合链的重复单元 的（分子内）连接而实现。可用的交联剂原理上不受任何特别限制，且本领域技术人员可根 据后续硫酸化的反应条件来选择交联剂。然而，在交联步骤中，优选使用双环氧化合物 (di邱oxide compounds)或其它具有可与纤维素的径基反应的至少两个反应性官能团的化 合物，例如二异氯酸醋、表氯醇、表漠醇、二甲基脈、二甲基乙基脈、二甲基氯硅烷、双(2-径 乙基讽）、二乙締基讽、亚烷基二面化物、径亚烷基二面化物和二环氧甘油酸。特别优选在交 联步骤中使用双环氧化合物。
[0068] 从二环氧甘油酸的组中，优选1,4-下二醇二环氧甘油酸、乙二醇二环氧甘油酸、丙 =醇二环氧甘油酸和聚乙二醇二环氧甘油酸。
[0069] 特别优选使用1,4-下二醇二环氧甘油酸或乙二醇二环氧甘油酸作为交联剂。
[0070] 任选地，可使用不同交联剂的混合物。
[0071] 交联可在水性介质中、有机溶剂中或者在水和有机溶剂的混合物中进行。交联优 选在水性介质中进行。
[0072] 优选使用交联催化剂，例如氨氧化钢或氨氧化钟，W加速纤维素与交联剂的交联。
[0073] 交联步骤中使用的介质的溫度可从约4°C