CV IRES的翻译控制下，并且使用HuH-7细胞来支持复制子的复制。 [0065]本发明化合物的抑制活性可使用本领域已知的多种分析方法来评价。例如，可使 用稳定的亚基因组复制子细胞系在细胞培养物中进行化合物表征，包括衍生自基因型Ia-H77、lb_N和Ib-Conl的那些，从University of Texas Medical Branch，Galveston，TX(la_ H77和lb-N)或者Apath，LLC，St. Louis，M0(lb-Conl)获得。可将插入来自感染基因型la或 Ib的人分离物的NS3基因的基因型Ia或Ib复制子的嵌合复制子用于测量对一组来自天然分 离物的靶蛋白的抑制活性。可将插入来自感染基因型3a、4或6的人分离物的NS3基因的基因 型Ia或Ib复制子的嵌合复制子用于测量对该基因型的代表的抑制活性。基因型Ia复制子构 建体含有源自HCV的H77株（la-H77)的NS3-NS5B编码区。该复制子也具有萤火虫荧光素酶报 告基因和新霉素磷酸转移酶(Neo)选择标记。被FMDV 2a蛋白酶分开的这两个编码区包含双 顺反子型复制子构建体的第一顺反子和含有添加适应性突变E1202G、K1691R、K2040R和 S2204I的NS3-NS5B编码区的第二顺反子。除了HCV 5' UTR、3' UTR和NS3-NS5B编码区源自 Ib-Conl或Ib-N株，并且对于lb-Conl，适应性突变是K1609E、K1846T和Y3005C，或者对于Ib-N，适应性突变是A1098T、E1202G和S2204I外，Ib-Conl和Ib-N复制子构建体与la-H77复制子 相同。另外，Ib-Conl复制子构建体在HCV IRES与荧光素酶基因之间含有脊髓灰质炎病毒 IRES。可将复制子细胞系保持于含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)、100IU/ml青霉素、100mg/ml 链霉素（Invitrogen)和200mg/ml G418(Invitrogen)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基 (DMEM)中。
[0066]本发明化合物对HCV复制的抑制作用也可通过测量由瞬时表达于细胞中的不含有 Neo选择标记的亚基因组复制子编码的荧光素酶报告基因的活性来测定。由la-H77、lb-N和 Ib-Con-I复制子编码的适应性突变与上文所列相同。用于这些瞬时分析的Ib-Conl复制子 含有NS2-NS5B编码区而非NS3-5B编码区。这些复制子可编码如对于稳定的亚基因组复制子 所述的靶NS3基因，或者其可编码使得对药物赋予不同程度敏感性的氨基酸变体。例如，变 体可包括基因型la NS3基因中的R155K、D168E或D168V;基因型lb NS3基因中的R155K或 D168V;基因型3a NS3基因中的S138T、A166T或Q168R。例如，可通过电穿孔用复制子转染细 胞并以每孔5000个细胞的密度接种至96孔板中的100μΙ含有5% FBS的DMEM中。将化合物稀 释于二甲亚砜(DMSO)中以产生一系列八个半对数稀释的200x原液，随后可将其于含有5% FBS的培养基中进一步稀释100倍，并加入到已经含有100μΙ具有5% FBS的DMEM的细胞培养 板中。3或4天孵育期后，可向每孔中加入30μ1被动裂解缓冲液(Promega )，孵育15分钟，同时 摇动以裂解细胞。可向每孔中加入荧光素溶液(l〇〇yl，Pr〇mega)，并且可用光度计测量荧光 素酶活性。可计算每个化合物浓度下HCV RNA复制的抑制百分比，并且可使用拟合至4-参数 逻辑斯谏方程的非线性回归曲线和GraphPad Prism 4软件来计算EC5Q值。
[0067]化合物1的抗病毒效果在稳定复制子细胞中通过测量萤火虫荧光素酶的降低来测 定。为了估计血浆蛋白对抗病毒活性的作用，该化合物在5% FBS存在进行测试。表2 (0%人 血浆）中的结果表明，化合物1针对基因型I a和I b复制子具有优异的效力，在5% FBS存在下 平均EC5q值范围为0.85至0.94 nM，以及针对基因型2a、3a、4a和6a复制子具有优异的效力， 在5% FBS存在下平均EC5q值范围为0.86至2.8 nM。表3 (40%人血浆）中的结果表明，在5% FBS存在下，化合物1针对基因型Ia和Ib复制子具有优异的效力，平均EC5q值范围为5至10 nM〇
[0068] 化合物1抑制含有来自GT 1&、113、2&、3&、4&或6 &的吧3基因的!1(^稳定亚基因组复 制子的复制，其中EC5Q值范围为0.85至2.8 nM。值得注意的是，化合物1针对含有GT3a蛋白酶 的复制子是有效力的，其中EC5q值为1.6 nM。化合物1保留其针对赋予针对其他HCV蛋白酶抑 制剂(Pis)的抗性的在NS3氨基酸位置155和168处的常见GTla和Ib变体的活性。GTla和Ib亚 基因组复制子细胞中的抗性集落选择研究将GTla中的A156T和GTlb中的A156V鉴定为最常 见变体，所述变体分别赋予对化合物1的1400倍和1800倍降低的敏感性。然而，这些变体的 体外复制能力仅为其相应野生型复制子的1.5%和9.2%。在含有GT3a NS3蛋白酶的复制子 中，化合物1在超过其EC50值2 100倍的浓度下选择非常少集落。在该选择后存活的集落含 有单独的A156G、或与Y56H共选择的Q168R，其分别赋予对化合物1的1500倍或1100倍的敏感 性损失。
[0069]表2. HCV亚基因组稳定复制子细胞培养测定中化合物1的抗病毒活性
a. 0%人血浆测定含有5%胎牛血清 b. 独立重复的数目 c. ND:未测定。
[0070]表3. HCV亚基因组稳定复制子细胞培养测定中化合物1的抗病毒活性
a. 0%人血浆测定含有5%胎牛血清 b. 独立重复的数目 c. ND:未测定。
[0071]本发明的前述描述提供了举例说明和描述，但并不意在穷举或将本发明限制到所 公开的精确方案。改变和变化鉴于上述教导是可能的，或者可以从本发明的实施中获得。因 此，应当指出，本发明的范围由权利要求及其等同方案所限定。
【主权项】
1. 治疗HCV的方法，所述方法包括将有效量的化合物1或其药学上可接受的盐施用于 HCV患者，其中所述患者感染任何的基因型2、3、4或6并且所述患者未针对所述治疗进行基 因分型。2. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型2。3. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型3。4. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型4。5. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型6。6. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型2、3、4和6。7. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型2a、3a、4a或6a。8. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型2a。9. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型3a。 1 〇.权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型4a。11. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型6a。12. 权利要求1的方法，其中所述患者感染HCV基因型2a、3a、4a和6a。13. 根据权利要求1-12之一的方法，其中所述化合物1或其盐与另一种抗HCV剂共同施 用。14. 根据权利要求1 -12之一的方法，其中所述化合物1与另一种HCV蛋白酶抑制剂或HCV 聚合酶抑制剂共同施用。15. 根据权利要求1 -12之一的方法，其中所述化合物1与另一种HCV蛋白酶抑制剂和HCV 聚合酶抑制剂共同施用。16. 根据权利要求1-15之一的方法，其中所述治疗持续少于24周且不包括将干扰素施 用于所述患者。17. 根据权利要求1-15之一的方法，其中所述治疗持续不超过12周且不包括将干扰素 施用于所述患者。18. 根据权利要求1-15之一的方法，其中所述化合物1与另一种HCV蛋白酶抑制剂或另 一种HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合共同施用，并且其中所述治疗持续少于24 周且不包括将干扰素施用于所述患者。19. 根据权利要求1-15之一的方法，其中所述化合物1与HCV蛋白酶抑制剂或HCV蛋白酶 抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合共同施用，并且其中所述治疗持续不超过12周且不包括 将干扰素施用于所述患者。20. 治疗HCV的方法，所述方法包括将有效量的化合物1或其药学上可接受的盐施用于 HCV患者，其中所述患者感染HCV基因型2、3、4或6。21. 权利要求20的方法，其中所述患者感染HCV基因型2。22. 权利要求20的方法，其中所述患者感染HCV基因型3。23. 权利要求20的方法，其中所述患者感染HCV基因型4。24. 权利要求20的方法，其中所述患者感染HCV基因型6。25. 根据权利要求20-24之一的方法，其中所述化合物1与另一种HCV蛋白酶抑制剂或另 一种HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合共同施用，并且其中所述治疗持续少于24 周且不包括将干扰素施用于所述患者。26.根据权利要求20-24之一的方法，其中所述化合物1与另一种HCV蛋白酶抑制剂或另 一种HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂的组合共同施用，并且其中所述治疗持续不超过 12周且不包括将干扰素施用于所述患者。
【专利摘要】用于治疗HCV的方法。
【IPC分类】A61K31/00, A61K31/12, A61K31/53, A61K31/498
【公开号】CN105658219
【申请号】
【发明人】L.C.吴, L.卢, T.德赫泰亚, T.雷施, R.L.特里帕蒂, R.皮萨瓦拉, C.A.科林斯, T.J.皮罗特-马蒂亚斯
【申请人】艾伯维公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年10月24日