个个体的炎症细胞数数，其结果下述表5。 rnn7?i r丰m
[0074]如上述表5所示，哮喘诱导群比起正常对照群，其炎症细胞的总数大幅增加，尤其 是嗜酸粒细胞的增加明显观察到。相反，EC-18给药群中嗜酸粒细胞数有减少，同时其炎症 细胞总数比起哮喘诱导群显著减少(图3)。
[0075] 实施例6:支气管肺泡灌洗液(BALF)内细胞因子分析
[0076] 利用酶免疫分析（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)工具（R&D SyStem，USA)来测定由各个个体分离出来的支气管肺泡灌洗液中的白介素（IL-4，IL-5，IL-13)的生成量。对各个细胞因子的分析按照制造方的实验方法实施，通过利用ELISA reader (Molecular Devices ,USA)仪，在450nm处测定了吸光度，其结果下述表6。
[0077] 【表6】
[0079] 如上述表6所示，作为Th2型的脂肪因子的IL-4在哮喘诱导群比起正常对照群大幅 增加，相反，在montelukast给药群比起哮喘诱导群有意地减少。同样，IL-4在EC-18给药群 的分泌比起哮喘诱导群显著减少。另外，针对IL-5和IL-13的分泌而言，在EC-18给药群比起 哮喘诱导群有大幅减少(图4)。
[0080] 实施例7:血清内IgE及卵清蛋白特异性IgE的测定
[0081] 通过后大静脉获取的血液在常温下进行30分钟反应以后，通过实施离心分离 (3000rpm, 15min)来获取血清。为了测定血清内的IgE及卵清蛋白特异性IgE，而利用了 ELISA方法。IgE使用市场上销售的IgE(Bi〇legend Ins.，USA)进行了测定，卵清蛋白特异性 IgE是在96-well flat bottom ELISA plate里把20yg/mL浓度的卵清蛋白溶于0· IM NaHCO3的缓冲液(pH 8.3)中，并在4 °C下进行了 16小时的反应。然后利用含有1 % bovine serum albumin(BSA)的PBS抑制了非特异性反应。血清试料以1:400进行稀释，并在室温下 进行2小时反应之后，利用含有0.05 % Tween 20的PBS进行了灌洗。把结合有过氧化酶 (peroxidase)的HRP-conjugated goat anti-rat IgG polyclonal A进行4000倍稀释，并 在室温下进行1小时反应之后，用3 · 3 ' 5 · 5 ' -tetramethylbenzidine substrate进行发色反 应，然后在450nm处测定吸光度，其结果为下述表7。
[0082] 【表7】
[0084]~如上述表7所示，哮喘诱发群的血清内
IgE比起正常对照群有显著增加，相反，作为 药物对照群的montelukast给药群则比起哮喘诱发群有意地减少。EC-18给药群也在所有给 药群里比起哮喘诱发群显著减少，观察到此与montelukast给药群类似。另外，卵清蛋白特 异性IgE在哮喘诱发群比起正常对照群大幅增加，相反，所有EC-18给药群比起哮喘诱发群 其卵清蛋白特异性IgE显著减少(图5)。
[0085] 实施例8:组织病理检查
[0086] 摘下肺后，即刻固定于10 %甲醛(f ormaIdehyde)溶液里后细切，利用流水进行8小 时水洗之后，进行环氧树脂（epoxy)包埋，再将其利用切片机(microtome)进行切片。然后， (1)为了观察肺组织内炎症进行Hematoxylin&Eosin染色；（2)哮喘引发时，支气管内黏液的 分泌会显著增加，为了观察此而实施periodic acid Schiff(PAS, IMEB Inc. ,USA)染色。利 用光学显微镜对肺组织的病理变化进行了镜检。
[0087] (1)观察肺组织内炎症反应的结果是，观察到哮喘诱发群的支气管及血管周围广 范围地扩散有炎症细胞，相反，montelukast给药群中则确认到这种炎症细胞的扩散有减 少，另外，在所有EC-18群中，确认到支气管及血管周围的炎症细胞的扩散有减少。观察到这 种减少与montelukast给药群类似(图6)。
[0088] (2)观察支气管内黏液分泌的结果的结果是，在哮喘诱发群中观察到支气管上皮 的杯状细胞的黏液分泌有增加。相反，在montelukast给药群中其黏液分泌有减少，另外，观 察到在所有EC-18给药群的支气管上皮的杯状细胞的黏液分泌显著减少(图7)。
[0089] 综上所述，本发明的所属技术领域的技术人员是能够明白不变更本发明的技术思 想或者必要的特征下可以以其他具体的形态实施。与此相关，可以理解为以上的技术例在 所有的面是一种例示，并且不仅限于此。解释为比起上述详细的说明，本发明的范围包括后 述的专利权利要求范围的含义及范围，以及从其等同概念得出的所有变更或者变形的形态 都应属于本发明的范围。
【主权项】
1. 一种哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，含有W下述化学式I表示的单乙 酷基二酷基甘油化合物作为有效成分； [化学式1]所述化学式中Rl及R2分别是碳数为14至20的脂肪酸基。2. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，所述Rl及R2分 别为由栋桐酷(931111；[1：〇71)、油酷(〇16〇71)、亚油酷（1；[]1〇16〇71)、亚麻酷（1；[]1〇16]1〇71)、硬 脂酷(Stearoyl)、十四酷(myristoyl)、花生四締酷(arachidonoyl)组成的群中选择。3. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，所述Rl及R2的 组合(R1/R2)由油酷/栋桐酷、栋桐酷/油酷、栋桐酷/亚油酷、栋桐酷/亚麻酷、栋桐酷/花生 四締酷、栋桐酷/硬脂酷、栋桐酷/栋桐酷、油酷/硬脂酷、亚油酷/栋桐酷、亚油酷/硬脂酷、硬 脂酷/亚油酷、硬脂酷/油酷、十四酷/亚油酷或者十四酷/油酷组成的群中选择。4. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，所述单乙酷基 二酷基甘油化合物是W所述化学式2表示的化合物。 [化学式2]5. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，所述单乙酷基 二酷基甘油化合物是从鹿茸分离的组合物。6. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，由IL-4、化-5 及IL-13组成的群中选择的所述单乙酷基二酷基甘油化合物减少细胞因子的分泌。7. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，所述单乙酷基 二酷基甘油化合物减少I巧的分泌。8. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，所述单乙酷基 二酷基甘油化合物减少支气管或血管周围的炎症细胞的数量，或者减少支气管上皮的杯状 细胞黏液的分泌。9. 根据权利要求1所述的哮喘的预防或治疗用药学组合物，其特征在于，所述组合物中 W所述化学式1表示的单乙酷基二酷基甘油化合物的含有量为0.001至50重量％; [化学式1]所述化学式中Rl及R2分别是碳数为14至20的脂肪酸基。10. -种哮喘的预防或改善用健康功能食品组合物，其特征在于，含有W下述化学式1 表示的单乙酷基二酷基甘油化合物作为有效成分； [化学式1]在所述化学式中Rl及R2分别是碳数为14至20的脂肪酸基。11. 根据权利要求10所述的慢性阻塞性肺病的预防或改善用健康功能食品组合物，其 特征在于，所述31及32分别由栋桐酷(931111；[1:〇71)、油酷(〇16〇71)、亚油酷（1;[]1〇16〇71)、亚 麻酷（1 inolenoyl)、硬脂酷（Stearoyl )、十四酷(myristoyl)、花生四締酷(arachidonoyl) 组成的群中选择。12. 根据权利要求10所述的慢性阻塞性肺病的预防或改善用健康功能食品组合物，其 特征在于，所述Rl及R2的组合(R1/R2)由油酷/栋桐酷、栋桐酷/油酷、栋桐酷/亚油酷、栋桐 酷/亚麻酷、栋桐酷/花生四締酷、栋桐酷/硬脂酷、栋桐酷/栋桐酷、油酷/硬脂酷、亚油酷/栋 桐酷、亚油酷/硬脂酷、硬脂酷/亚油酷、硬脂酷/油酷、十四酷/亚油酷或者十四酷/油酷组成 的群中选择。13. -种哮喘的预防或治疗方法，其特征在于;包括将权利要求1至9之一所述的组合物 对非人类个体给药的步骤。
【专利摘要】本发明涉及含有以单乙酰基二酰基甘油化合物作为有效成分的哮喘的预防或者治疗用药学组合物、哮喘的预防或改善用健康功能食品组合物。本发明的单乙酰基二酰基甘油化合物在小鼠T细胞淋巴瘤细胞EL-4细胞中抑制IL-4的表达，在哮喘诱发动物模型中能够减轻气道过敏性、抑制支气管内炎症细胞的扩散。另外，本发明的化合物在抑制血清和支气管肺泡灌洗液内的IgE的生成、抑制在肺内Th2细胞因子(IL-4、IL-5及IL-13)的表达上有非常好的效果，所以可以克服现阶段使用的哮喘治疗剂的副作用，作为无毒性且治疗效果卓越的化合物可以有益的使用为哮喘的预防、治疗及改善用组合物。
【IPC分类】A61K31/22, A61P11/06
【公开号】CN105658213
【申请号】
【发明人】吴世湸, 安境燮, 李洙义, 申寅植, 慎娜来, 李太锡, 姜钟求, 丁永植, 韩龙海, 孙起荣
【申请人】Enzychem生命科学株式会社, 韩国生命工学研究院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年8月19日