型和突变型质粒混合成0%、5%、10%、15%、25%、50%、75%、100%突变比例 梯度样本。
[0072] 1.3.2 样本PCR扩增 分别用PCR反应液A、B对样本进行扩增(采用QIAGEN公司的实时荧光定量PCR分析仪(型 号:Rotor-Gene Q)，反应体系为40μ1，每个样本分别用3批试剂各检测8次，总计24次。PCR反 应条件如下：95°C 15分钟，95°C 15秒，58°C 20秒，72°C 30秒，循环50次。
[0073] 1.3.3焦磷酸测序 采用QIAGEN公司的PyroMark Gold Q24 Reagents试剂盒和实时定量焦磷酸序列分析 仪(型号:PyroMark ? Q24 MDx)，按照制造商说明书方法和条件进行操作，测序弓丨物的杂交 条件为:80°C加热1.5min，室温退火20分钟。测序仪自动得出每个位点上的碱基的百分数， 即为该位点的碱基比例的检测值，并与理论值相比较。
[0074] 下表3给出了 PCR反应和焦磷酸测序过程中所使用的各靶基因、PCR引物、测序引 物、待分析序列、分配顺序和靶序列之间的关系以及相应的序列。
[0075] 表3.靶基因、PCR引物、测序引物、待分析序列、分配顺序(D0)和靶序列之间的关 系以及相应的序列
绫I ''产表承读魏A可翁騎緣蠢 >,辨參C溢表衆翁維j,鮮 资:戴0讀藤Λ 1.4结果及分析 图2给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 3)对野生型质粒rtl73和rtl69位点处的 基因突变检测结果的一个截图，图3给出了使用本发明测序引物（SEQ ID NO: 7)对野生型 质粒rtl84、rtl81和rtl80位点处的基因突变检测结果的一个截图，图4给出了使用本发明 测序引物(SEQ ID NO: 11)对野生型质粒rtl94位点处的基因突变检测结果的一个截图，图 5给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 17)对野生型质粒rt204和rt202位点处的基因 突变检测结果的一个截图，图6给出了使用本发明测序引物(SEQ ID NO: 21)对野生型质粒 rt236位点处的基因突变检测结果的一个截图，图7给出了使用本发明测序引物（SEQ ID NO: 25)对野生型质粒rt250位点处的基因突变检测结果的一个截图。从图2-7可知，本发明 测序引物能够快速准确地检测出乙型肝炎病毒耐药性基因中的突变，测序特异性高，且测 序背景低。
[0076]下表4给出了对各位点突变比例梯度的检测结果，结果显示:突变比例的检测值与 理论值较接近，检测准确性较高；各位点的标准偏差较小，显示出良好的精密度;各位点的 突变型碱基检测值与理论值呈现良好的线性关系，线性拟合的相关系数均大于0.98(见图 8)。因此，本发明的测序引物可应用于定量检测且检测准确性高。
[0077] 表4:突变比例的理论值与检测值
实施例2:本发明测序引物对临床来源的样本的测序 本实施例中所用的材料、仪器与方法及条件均同实施例1，但所测序的样本为来自医院 的包含乙型肝炎病毒的临床血浆样本，其经Nucleic Acid Purification Kit(QIAGEN)处 理后得到HBV病毒核酸，然后按照实施例1进行样本PCR扩增和焦磷酸测序。
[0078]本发明表3所示各测序引物对临床样本的测序结果见图9。
[0079]从图9可知，本发明表3所示各测序引物能用于对临床来源的样本进行测序，从而 可用于指导患者根据耐药情况选择最佳的治疗方案。
[0080]实施例3:不同测序引物的测序结果之间的比较 本实施例中所用的材料、仪器与方法及条件均同实施例1，但在焦磷酸测序过程中使用 了不同的测序引物。测序结果见图10。
[00811图10为对野生型质粒rt204/202位点使用不同测序引物的测序结果图。以A4和A8 孔为例，相同的样本使用不同测序引物和相同的D0其测序质量完全不同（A4孔显示红色测 序失败，而A8孔(本发明测序引物)显示蓝色测序成功）。
[0082]另外对不同的PCR引物和测序引物进行了类似的比较筛选，根据测序结果（未显 亦)最终选择了表3的引物序列D
【主权项】
1. 用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的测序引物，所述 测序引物包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25。2. 权利要求1的测序引物，其中所述测序引物具有至少一个选自以下的核苷酸序列： SEQ ID NO: 3、7、11、17、21和25。3. 权利要求1或2的测序引物，其中所述测序引物针对的靶标序列为选自以下的序列： SEQ ID NO: 6、10、14、20、24和28以及它们的任意组合。4. 一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的试剂盒或微 阵列，其包含权利要求1 -3中任一项的测序引物。5. 权利要求4的试剂盒或微阵列，其还包含至少一种选自以下的引物组： 1) 引物组1，其包含具有由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物;和 2) 引物组2,其包含具有由SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的引物。6. 权利要求4或5的试剂盒或微阵列，其还包含表明至少一种选自以下的待分析序列和 分配顺序的说明书： 1) 由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序； 2) 由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 9所示的分配顺序； 3) 由SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 13所示的分配顺序； 4) 由SEQ ID NO: 18所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 19所示的分配顺序； 5) 由SEQ ID NO: 22所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 23所示的分配顺序;和 6) 由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 27所示的分配顺序。7. 权利要求1-3中任一项的测序引物在制备用于基于焦磷酸测序技术检测样品中的乙 型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的试剂盒或微阵列中的用途。8. 权利要求7的用途，其中所述试剂盒或微阵列还包含至少一种选自以下的引物组： 1) 引物组1，其包含具有由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物;和 2) 引物组2,其包含具有由SEQ ID NO: 15所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的引物。9. 权利要求7或8的用途，其中所述试剂盒或微阵列还包含表明至少一种选自以下的待 分析序列和分配顺序的说明书： 1) 由SEQ ID NO: 4所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 5所示的分配顺序； 2) 由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 9所示的分配顺序； 3) 由SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 13所示的分配顺序； 4) 由SEQ ID NO: 18所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 19所示的分配顺序； 5) 由SEQ ID NO: 22所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 23所示的分配顺序;和 6) 由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 27所示的分配顺序。10. 权利要求7或8的用途，其中所述样品为生物样品，优选所述样品为体液样品或组织 样品，和更优选所述样品选自活组织检查样品、细胞培养物、经固化处理的样品（如石蜡包 埋样品）、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁和 腹膜液。
【专利摘要】本发明涉及基于焦磷酸测序技术的乙型肝炎病毒（HBV）耐药性基因检测技术。具体而言，本发明涉及用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的测序引物。本发明还涉及包含测序引物的用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒和微阵列。本发明还涉及测序引物在制备用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用测序引物检测样品中的乙型肝炎病毒（HBV）耐药基因突变的方法。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105648099
【申请号】
【发明人】陈华, 刘小青, 隋少飞
【申请人】凯杰生物工程（深圳）有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月25日