基于焦磷酸测序技术的乙型肝炎病毒（hbv）耐药性基因检测技术的利记博彩app
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基于焦磷酸测序技术的乙型肝炎病毒(HBV)耐药性基因检测技术。具 体而言，本发明涉及用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的测 序引物。本发明还涉及包含测序引物的用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV) 耐药基因突变的试剂盒和微阵列。本发明还涉及测序引物在制备用于基于焦磷酸测序技术 检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的试剂盒和微阵列中的用途。本发明还涉及使用测 序引物检测样品中的乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的方法。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎病毒(HBV)感染已成为全球严重的公共卫生问题，严重危害着人类的健 康。全球约有20亿HBV感染者，其中约有4亿将发展为乙肝，全球每年约有60万人死于与HBV 感染相关的疾病。目前，广泛应用的抗HBV药物主要有两类，即α2干扰素和核苷类药物。核苷 类药物中主要是拉米夫定和伐昔洛韦。拉米夫定是近年新发现的具有抗HBV作用的核苷类 药物，适用于体内HBV复制活跃且滴度较高的慢性乙型肝炎患者的治疗，包括部分对干扰素 禁忌或干扰素治疗无效的患者。但该类药物需要长期服用，且易产生耐药，其中最主要的是 长期服用该药可引起编码HBV DNA聚合酶的Ρ基因变异。
[0003] 临床上HBV治疗药物耐药研究： ①拉米夫定是目前应用最广、时间最长的药物，其主要的耐药突变位点有rt204、 rtl80。耐药的分子机制可能为rt204位点参与形成了拉米夫定与聚合酶的结合部位，rt204 突变后降低了拉米夫定与dNTP底物的亲和力，降低突变株的复制力，从而降低拉米夫定的 抗病毒作用。其他突变位点有竹169、竹173、竹180、竹184等。
[0004] ⑤柯德福韦酯属于无环嘌呤类核苷酸类似物。相关的耐药突变多为多点突变，主 要耐药位点有rtl81、rt236。
[0005] 恩替卡韦对初治患者很少发生耐药，但在拉米夫定失效患者中耐药发生率明显 增加。恩替卡韦耐药变异需要在rt204+rtl80位突变的基础上，再联合rtl84、rt202、rt250 和rtl69位点上一个或多个氨基酸突变。
[0006] φ替比夫定与拉米夫定耐药基因序列相似，但其耐药发生率更低。耐药突变位点 为rt204。
[0007] ⑤替诺福韦是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，有报道称其耐药与rtl94变异 有关，能改变DNA与dNTP底物的结合位点，从而影响DNA合成。
[0008] 现已有多种生物学检测技术应用于HBV基因变异检测，如聚合酶链反应-逆向点杂 交、PCR-限制性片断长度多态性、基因芯片、限制性片段质谱多态性技术、实时PCR、PCR产物 直接测序等。
[0009] 聚合酶链反应-逆向点杂交操作繁琐，成本高。PCR-限制性片断长度多态性分析只 能分析已知序列特异位点的基因突变，且有些耐药突变很难找到合适的限制性内切酶，因 此检测的突变类型有限。基因芯片样本的制备和标记较繁琐，仪器昂贵，检测成本高。限制 性片段质谱多态性技术也只能分析已知序列且价格昂贵。实时PCR需要针对每个位点设计 探针，随着耐药位点增多，成本增高。同时一些非测序方式需要依赖酶切或聚类的方式判读 患者的基因突变情况，存在较大的分型错误的几率。直接测序虽然准确度高，但测序反应产 生的DNA片段需要经过毛细管电泳分离，其后由检测系统检测荧光信号，耗时较长且检测成 本较高。
[0010]焦磷酸测序法可对一定长度内序列进行实时定量分析，其重复性和精确性能与 Sanger测序媲美，而检测速度大大提高，检测成本明显降低。此外，焦磷酸测序技术的检测 灵敏度也远高于Sanger测序。目前该技术已广泛应用于微生物鉴定及分法医学鉴、遗传学 分析、SNP检测等方面。因此，焦磷酸测序技术在HBV基因变异检测的应用与推广将具有极大 价值与潜力。
[0011]然而，目前尚没有商业化实现焦磷酸测序技术在乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突 变检测的方案。
【发明内容】
[0012] 本发明一方面涉及用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突 变的测序引物，所述测序引物包含至少一个选自以下的核苷酸序列：SEQ ID N0: 3、7、11、 17、21和25以及它们的任意组合。在一个实施方案中，所述测序引物具有至少一个选自以下 的核苷酸序列，或者由或基本由至少一个选自以下的核苷酸序列组成：SEQ ID N0: 3、7、 11、17、21和25以及它们的任意组合。在另一个实施方案中，所述测序引物针对的靶标序列 为选自以下的序列：SEQ ID N0: 6、10、14、20、24和28以及它们的任意组合。
[0013] 本发明一方面涉及用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突 变的测序引物组，所述测序引物组包括： 包含或具有选自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25之一的核苷酸序列的测序引物，和 包含或具有选自SEQ ID N0: 3、7、11、17、21和25的另外一个、另外两个、另外三个、另 外四个或全部另外五个的核苷酸序列的测序引物。
[0014] 本发明另一方面涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药 基因突变的试剂盒或微阵列，其包含本发明的测序引物或测序引物组。本发明另一方面涉 及本发明的测序引物或测序引物组在制备用于基于焦磷酸测序技术检测样品中的乙型肝 炎病毒(HBV)耐药基因突变的试剂盒或微阵列中的用途。
[0015] 在一个实施方案中，所述试剂盒或微阵列还包含至少一种选自以下的引物组： 1) 引物组1，其包含具有由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物;和 2) 引物组2,其包含具有由SEQ ID N0: 15所示的核苷酸序列的引物和具有由SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列的引物。
[0016] 在一个实施方案中，所述试剂盒或微阵列还包含表明至少一种选自以下的待分析 序列和分配顺序的说明书： 1)由SEQ ID N0: 4所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 5所示的分配顺序； 2) 由SEQ ID NO: 8所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 9所示的分配顺序； 3) 由SEQ ID NO: 12所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 13所示的分配顺序； 4) 由SEQ ID NO: 18所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 19所示的分配顺序； 5) 由SEQ ID NO: 22所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 23所示的分配顺序;和 6) 由SEQ ID NO: 26所示的待分析序列和由SEQ ID NO: 27所示的分配顺序。
[0017] 本发明还涉及一种基于焦磷酸测序技术检测样品中的乙型肝炎病毒(HBV)耐药基 因突变的方法，所述方法包括： (1) 提取和任选纯化样品中的DNA， (2) 将提取和任选纯化的DNA进行扩增，从而获得扩增产物， (3) 对步骤(2)的扩增产物进行焦磷酸测序。
[0018] 在一个实施方案中，所述焦磷酸测序使用本发明的测序引物或测序引物组进行。 在另一个实施方案中，所述扩增为PCR扩增，优选所述PCR扩增使用本发明的引物组。在又一 个实施方案中，检测样品中的乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的方法可不用于诊断受试 者的耐药性，例如可用于检测体外培养中的乙型肝炎病毒是否变异，可用于检测环境来源 的乙型肝炎病毒样品是否具有耐药性。
[0019] 在一个实施方案中，所述焦磷酸测序还使用至少一种选自以下的待分析序列和分 配顺序： 1) 由SEQ ID N0: 4所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 5所示的分配顺序； 2) 由SEQ ID N0: 8所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 9所示的分配顺序； 3) 由SEQ ID N0: 12所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 13所示的分配顺序； 4) 由SEQ ID N0: 18所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 19所示的分配顺序； 5) 由SEQ ID N0: 22所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 23所示的分配顺序;和 6) 由SEQ ID N0: 26所示的待分析序列和由SEQ ID N0: 27所示的分配顺序。
[0020] 在一个实施方案中，所述样品为生物样品，优选所述样品为体液样品或组织样品， 和更优选所述样品选自活组织检查样品、细胞培养物、经固化处理的样品（如石蜡包埋样 品）、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁、腹膜 液。
【附图说明】