[0021 ]图1为焦磷酸测序的一个技术流程及各主要元素示意图。
[0022] 图2为使用本发明测序引物(SEQ ID N0: 3)对野生型质粒rtl73和rtl69位点处的 基因突变检测结果的一个截图（所检测样本为0%突变比例理论值的基因野生型质粒），其中 横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
[0023] 图3为使用本发明测序引物（SEQ ID N0: 7)对野生型质粒rtl84、rtl81和rtl80位 点处的基因突变检测结果的一个截图（所检测样本为〇%突变比例理论值的野生型质粒），其 中横坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所米集到的焚光信号强度。
[0024]图4为使用本发明测序引物(SEQ ID N0: 11)对野生型质粒rtl94位点处的基因突 变检测结果的一个截图（所检测样本为〇%突变比例理论值的野生型质粒），其中横坐标代表 分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
[0025] 图5为使用本发明测序引物（SEQ ID NO: 17)对野生型质粒rt204和rt202位点处 的基因突变检测结果的一个截图（所检测样本为〇%突变比例理论值的野生型质粒），其中横 坐标代表分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
[0026]图6为使用本发明测序引物(SEQ ID N0: 21)对野生型质粒rt236位点处的基因突 变检测结果的一个截图（所检测样本为〇%突变比例理论值的野生型质粒），其中横坐标代表 分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
[0027]图7为使用本发明测序引物(SEQ ID N0: 25)对野生型质粒rt250位点处的基因突 变检测结果的一个截图（所检测样本为〇%突变比例理论值的野生型质粒），其中横坐标代表 分配序列，纵坐标代表仪器所采集到的荧光信号强度。
[0028]图8为使用包括本发明的测序引物在内的测序体系所检测到的rtl69、rtl73、 ^180、竹181、^184、^194、竹202、^204、^236和竹250位点处的基因突变的检测值与理 论值相比较的曲线图。
[0029]图9为使用本发明表3所示各测序引物对临床来源的样本的测序结果的截图。图 9A:rtl73和rtl69位点，图9B:rtl84、rtl81 和rtl80位点，图9C:rtl94位点，图9D:rt204和 rt202位点，图9E:rt236位点，和图9F:rt250位点。
[0030]图10为对野生型质粒rt204/202位点使用不同测序引物的测序结果图。
【具体实施方式】
[0031]参考用于说明的示例应用在下文中描述本发明的数个方面。应当理解的是，陈述 许多具体细节、关系和方法来提供对本发明的充分理解。然而，在相关领域的普通技术人员 将容易地认识到，可在不含一个或多个具体细节的情况下实施本发明或者可用其他方法来 实施本发明。
[0032]本发明目的在于解决现有技术中对乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的检测的缺 点，例如较大的分型错误、耗时较长或检测成本较高。本发明通过使用本发明的测序引物的 焦磷酸测序技术而解决了上述问题。
[0033]使用本发明的测序引物的焦磷酸测序技术具有以下优点： 1) 仪器及试剂通过系统优化，可达到最优的检测效果，且易标准化； 2) 检测结果自动由软件给出，避免结果判断主观性； 3) 操作过程简便且省时，检测全程190分钟，其中仪器自动运行时间170分钟，手工操作 时间20分钟； 4) 检测灵敏度可低至5%突变比例； 5) 线性度高，能用于定量检测。
[0034]除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语具有本发明所属领域普通技术人员 通常理解的含义。在细胞和分子生物学中的普通术语的定义可以参见：余龙等译的基因 VIII，标准书号：ISBN: 978-7-03-014597-0,科学出版社出版(2005);张瑾峰等译的细胞与 分子生物学，中信出版社出版（2004)，ISBN: 978-7-50-860075-8;和王镜岩等编的生物化 学，高等教育出版社出版（2002)，ISBN:978-7-04-011088-3; Kendrew，J.等人（编）， The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版(1994), ISBN 0-632-02182-9;和Meyers, R.A.(编），Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版（1995)，ISBN 1-56081-5698。虽然在实施本发明时可采用类似或等同于本文所述方法和材料的任何方法和 材料，但是本文描述了具体的材料和方法。
[0035] 样品 本发明所用的样品可以是生物来源、环境来源、医学来源或患者来源的一定量的材料。 一方面，它可包括标本或培养物(例如微生物培养物）。另一方面，它也可包括但不限于生物 学样品和非生物样品（例如环境样品和工业样品等）。生物学样品可包括采自受试者的材 料，其包括但不限于体液样品（例如血液、血清、血浆、唾液、尿液、组织液、精液、分泌液、脓 汁和呼吸液(respiratory fluid)和粘液)和组织样品（例如活组织切片等）。生物学样品可 获自人受试者或其它动物。环境样品是指取自例如自然环境、生活环境、工作环境和生产环 境等的样品，包括但不限于天然食物、表面物质、土壤、水。工业样品是指取自工业制品的样 品，包括但不限于从加工食品和奶制品、加工设备、仪器、装置、器具、一次性用品和非一次 性用品中获得的样品。这些实例不能理解为限制适用于本发明的样品类型。获自来源的样 品或在预处理以改进样品特征(例如从血液制备血浆等)后的样品可直接使用。
[0036] 可按照本发明进行分析和/或使用的样品包括临床来源的多核苷酸，例如DNA或 RNA〇
[0037] 从样品中提取核酸的方法是本领域众所周知的，可用例如苯酚和氯仿进行DNA提 取，或者使用市售DNA提取试剂进行提取。例如，可使用柱试剂盒(例如GENERATION (注册商 标）Capture Column Kit Gentra)进行提取。
[0038] 应该理解的是，核酸可通过本领域众常规的纯化方法来纯化，例如使用PrepSEQ TM 试剂盒(来自Applied Biosystems)和美国专利号5,234,809中的方法等等。
[0039] 耐药性又称抗药性，系指微生物、寄生虫以及肿瘤细胞对于化疗药物作用的耐受 性。在本发明中，耐药性是指乙型肝炎病毒的耐药性，特别是指乙型肝炎病毒对临床上对乙 型肝炎常用的药物(包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦等）的耐药 性。耐药性基因在本发明的一些实施方案中是指在rtl69、rtl73、rtl80、rtl81、rtl84、 竹194、竹202、竹204、竹236和/或竹250等突变位点上发生突变的基因。
[0040] 引物 本文所用的"引物"通常指与靶序列互补和退火的线性寡核苷酸。引物长度的下限按杂 交能力而定，因为非常短的引物(例如小于5个核苷酸)在大多数杂交条件下不形成热力学 稳定的双链体。引物长度通常在8-50个核苷酸内变化。在某些实施方案中，引物介于大约 15-25个核苷酸之间。天然存在的核苷酸(尤其是鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下 文称为"G"、"A"、"C"和"T"）以及核苷酸类似物，都可用于本发明的引物。本文使用的术语 "测序引物"是指用于起始对核酸进行的测序反应的寡核苷酸引物。
[0041] 本文使用的"扩增产物"是指自核酸模板，通过核酸扩增而产生的扩增的核酸。
[0042] 本文使用的"模板DNA"或"模板RNA"是指作为用于扩增的所需靶标的核酸。例如， 模板RNA被逆转录为cDNA，并且该模板cDNA用于产生扩增产物。
[0043] 本文使用的术语"核苷酸类似物"指与天然存在的核苷酸在结构上相似的化合物。 核苷酸类似物可以具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。通常具有改变的核碱基 的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。具有改变的磷酸-糖骨架的核 苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA))通常尤其改变链特性，例如二级结构形成。 [0044]用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的PCR引物、测序 引物及靶系列的实例如表3。
[0045] 本发明的PCR引物和测序引物的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的 扩增或测序效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加 一个或多个核苷酸残基、在核苷酸序