选自以下的待分析序列和/或分配顺序： 1) 由SEQ ID N0: 4所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 5所示的分配顺序； 2) 由SEQ ID N0: 8所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 9所示的分配顺序； 3) 由SEQ ID N0: 12所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 13所示的分配顺序； 4) 由SEQ ID N0: 18所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 19所示的分配顺序； 5) 由SEQ ID N0: 22所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 23所示的分配顺序;和 6) 由SEQ ID N0: 26所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 27所示的分配顺序。
[0059] 待分析序列是测序实验完成后进行结果分析时使用的，分析仪的软件将此待分析 序列与测序结果进行比对。比如待分析序列为GCCG/TCGGCGAG/TAC/TGATA/TGGT/ATGT/ ACGGGGT，软件就会对标注有7"的位点计算突变的比例;在实际应用中，比例值会随着样本 而变化，这个比例值则指示突变的程度。分配顺序是仪器在进行测序过程中喷出的核苷酸 底物的顺序;测序时，仪器按照分配顺序按次序将核苷酸底物加入反应池中，如果喷入A时 检测到荧光信号，就代表这个位点的测序结果为A，以此类推。本领域技术人员可根据需要 常规地选择和设计待分析序列和/或分配顺序，并在实际应用中根据具体的靶序列的情况 而使用不同的待分析序列和/或分配顺序。在一个实施方案中，焦磷酸测序可使用如表3所 示的分析序列和/或分配顺序。本领域技术人员能够理解的是，引物组、测序引物、分析序列 和分配顺序均根据具体的靶序列而相应地变化。
[0060] 试剂盒 本发明涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的试 剂盒，其含有本发明的测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物 组)与引物组的组合。本发明还涉及本发明测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物 (或本发明测序引物组)与引物组的组合在制备用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病 毒(HBV)耐药基因突变的试剂盒中的用途。在一个实施方案中，所述测序引物可包含或具有 至少一个(例如至少2、3、4、5或全部6个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID N0: 3、7、11、17、 21和25。在一个实施方案中，所述引物组为选自引物组1和引物组2的至少一个引物组。
[0061] 试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括测序引物和引物组）。试剂 盒可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、dNTP、酶等）和/或支持材料(例如缓 冲液、实施检测的说明书等）。例如，试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支 持材料的容器(例如盒子）。这样的内容物可一起或分开递送给既定的接受者。例如，第一个 容器可含有用于测定的酶，第二个容器含有引物组、而第三个容器含有测序引物。所述试剂 盒还可含有适合容纳所述试剂或容器的隔室。作为一个实例，试剂盒可含有测序引物、引物 组、PCR反应缓冲液、使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有UNG、用 于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样品制备核酸例如DNA的试剂。 本发明试剂盒还可包含除了本发明的测序引物和/或引物组之外的其它任何测序引物和/ 或引物组，例如能够有效检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的测序引物和/或引物组。 以上实例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。
[0062]在一个实施方案中，试剂盒中的说明书表明了焦磷酸测序所用的分析序列和/或 分配顺序为下列的至少一种： 1) 由SEQ ID N0: 4所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 5所示的分配顺序； 2) 由SEQ ID N0: 8所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 9所示的分配顺序； 3) 由SEQ ID N0: 12所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 13所示的分配顺序； 4) 由SEQ ID N0: 18所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 19所示的分配顺序； 5) 由SEQ ID N0: 22所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 23所示的分配顺序;和 6) 由SEQ ID N0: 26所示的待分析序列和/或由SEQ ID N0: 27所示的分配顺序。
[0063] 微阵列 本发明涉及一种用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变的微 阵列，其含有本发明的测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物(或本发明测序引物 组)与引物组的组合。本发明还涉及本发明测序引物(或本发明测序引物组)或者测序引物 (或本发明测序引物组)与引物组的组合在制备用于基于焦磷酸测序技术检测乙型肝炎病 毒(HBV)耐药基因突变的微阵列中的用途。在一个实施方案中，所述测序引物可包含或具有 至少一个(例如至少2、3、4或全部5个)选自以下的核苷酸序列：SEQ ID N0: 3、7、11、17、21 和25。在一个实施方案中，所述引物组为选自引物组1和引物组2的至少一个引物组。
[0064] 微阵列是指具有平坦表面的固相支持体，其具有核酸阵列，阵列中的各个成员包 含固定在空间上确定的区域或位点上的寡核苷酸或多核苷酸的相同的拷贝，所述区域或位 点不与阵列中的其它成员的区域或位点重叠;也就是说，所述区域或位点在空间上是离散 的。此外，空间上确定的杂交位点可为"可寻址的"，因为其位置及其固定化的寡核苷酸的身 份是已知或预先确定的（例如在其使用前是已知或预先确定的）。通常寡核苷酸或多核苷酸 为单链，并通常由5'-端或3'-端与固相支持体共价连接。微阵列中含有非重叠区的核酸的 密度通常大于l〇〇/cm 2,更优选大于1000/cm2。微阵列技术公开于例如以下参考文献中： Schena编辑的Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Current Opin. Chem. Biol·, 2:404_410，1998,其全部内容通过引用结合到 本文中。
[0065]虽然上文已描述了本发明的各种实施方案，但是应理解的是，其仅以实例的方式 提供，而并非限制。对公开的实施方案的许多改变可依照本文的公开内容来进行，而不会背 离本发明的精神或范围。因此，本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。
[0066]本文提及的所有文献都通过引用结合到本文中。本申请引用的所有出版物和专利 文件都为所有目的而通过引用结合，引用程度如同单独地指出各个出版物或专利文件一 样。 实施例
[0067] 除非另外说明，否则本文实施例所用的材料均市购获得，用于进行实验的各种具 体实验方法均为本领域常规的实验方法(参见例如F.奥斯伯等主编的《精编分子生物学实 验指南》（1999)，科学出版社，ISBN 7-03-006408-9和J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实 验指南(第三版)》（2002)，科学出版社，ISBN 7-03-010338-6)或者按照制造商所建议的步 骤和条件，并能由本领域技术人员根据需要常规地确定。以下对某些材料和方法进行了详 述。
[0068] 实施例1:使用本发明测序引物进行的焦磷酸测序 材料和方法 1.1材料 表1:本发明所使用的材料及来源
选取HBV野生型（SEQ ID N0: 29)和突变型（SEQ ID N0: 30)质粒（由Invitrogen合 成），质粒10个检测位点的氨基酸类型及核苷酸序列详见表2。
[0069]表2:质粒10个检测位点的氨基酸类型及核酸序列 1.2设备
QIAGEN公司Rotor-gene Q PCR仪和PyroMark? Q24 MDx测序仪。
[0070] 1.3方法 如图1所示，首先采用PCR反应液和HS Taq对纯化的HBV基因组DNA在Rotor-Gene Q平台 上进行扩增，PCR反应液中包含荧光染料，在扩增过程中能够嵌入不断增加的PCR双链产物 中。因此整个产物富集的过程能够通过Rotor-Gene Q的软件进行实时监测，从而确保质量 可靠的PCR产物用于后续焦磷酸测序分析。通过PyroMark Q24真空工作站对PCR产物进行处 理，最终获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。之后在PyroMark Q24焦磷酸测序仪上运 行特定的焦磷酸测序程序，仪器会根据特别设计的分配顺序（D0)的顺序依次加入四种 dNTP，通过酶与底物的级联反应，dNTP在单链产物上的有效延伸以光信号的形式被仪器接 收，并最终以信号峰的形式实时出现在软件界面中。运行后的结果由软件进行自动分析，减 少了人工分析的负担和误差。
[0071] 1.3.1样本制备 取等浓度的野生