胞碎片；（2) 0. 45 μ m滤器过滤上清液于 40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后， 将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不 超过l〇〇〇g; (5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒 浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO: 18所示。对照慢病毒的包装过程同YEATS4-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 载体代替 pGCSIL-GFP-YEATS4-siRNA 载体。
[0105] 实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测YEATS4基因的沉默效率
[0106] 处于对数生长期的结肠癌RK0细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为 5父10 4/1111)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（101，服0:10) 值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收 集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的 M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表7,42°C反应lh，然后在 70°C水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活）。
[0107] 采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA)进行实时定量检测。YEATS4基因 的引物如下：上游引物 5 ' -TCATAGAACTCTGAAACCACTGTC-3 '（SEQ ID N0 :13)和下游引 物 5' -CCTGTAACCCTGTATCATTTGCTA-3'（SEQ ID NO :14)。以管家基因 GAPDH 为内参， 引物序列如下：上游引物5 ' -TGACTTCAACAGCGACACCCA-3 '（SEQ ID NO : 15)和下游引物 5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'（SEQ ID N0:16)。按表 8 中的比例配置反应体系。
[0108] 表7逆转录反应体系
[0109]
[0110] 表 8Real_time PCR 反应体系
[0111]
[0112] 设定程序为两步法Real-time PCR :预变性95°C，15s ;之后每一步变性95°C，5s ; 退火延伸60°C，3〇S;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95°C变 性lmin，然后冷却至55°C，使DNA双链充分结合。从55°C开始到95°C，每一步增加0. 5°C， 保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-Δ 分析法计算侵染了 YEATS4mRNA的表 达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果（图2)表明，结肠癌 RK0细胞mRNA的表达水平下调了 62. 9%。
[0113] 实施例3检测侵染了 YEATS4_siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
[0114] 处于对数生长期的结肠癌RK0细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为 5 X 104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30 %。根据侵染复数（Μ0Ι，RK0 :10)， 加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收集处于对数生长期 的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2 X 104/ml)，以细胞密度约为2000个/孔， 接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μΙ。铺好板后，置37°C、5%C0 2培养箱培养。从铺 板后第二天开始，每天用Cellomics仪器（Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5 天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色 荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果如图3)。结果表明，慢 病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的 增殖速度，活力细胞数目分别下降了 67. 9%，表明YEATS4基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力 被抑制。
[0115] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出 若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 一种分离的人YEATS4基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物 中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自结肠癌。3. -种降低肿瘤细胞中YEATS4基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含： a) 双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与YEATS4基因杂交的核苷酸序 列；或者 b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与YEATS4基因杂交的核苷酸序列。4. 如权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二 链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与YEATS4 基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与YEATS4基因中的靶序列基本相同。5. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述YEATS4基因的靶序列含 有SEQ ID NO: 1-5的序列。6. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA， 该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO :17所示。7. 如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQ ID NO :18所示。8. -种YEATS4基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的 核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。9. 如权利要求8所述YEATS4基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述YEATS4基因干扰 核酸构建体为干扰慢病毒载体。10. 如权利要求9所述YEATS4基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体 由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自： pLKO. l-puro、pLK0. l-CMV-tGFP、pLKO.l-pur〇-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、 pLKO. l-Neo、pLK0. l-Ne〇-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagYFP、pLKO. l-pur〇-CMV-TagRFP、pLKO.l-pur〇-CMV-TagFP635、 pLKO.l-pur〇-UbC-TurboGFP> pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635> pLK〇-pur〇-IPTG-lxLacO> pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ 中的任 o11. 一种YEATS4基因干扰慢病毒，由权利要求9-10任一权利要求所述干扰慢病毒载体 在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。12. -种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有权利要求3-7任一权利 要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述YEATS4基因干扰核酸构建 体，和/或权利要求11所述的YEATS4基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂 或赋形剂。13. 权利要求12所述药物组合物在制备治疗结肠癌的肿瘤治疗药物中的应用。14. 一种用于降低肿瘤细胞中YEATS4基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 括：存在于容器中的，权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任 一权利要求所述YEATS4基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的YEATS4基因干扰 慢病毒。
【专利摘要】本发明公开了人YEATS4基因的用途及其相关药物。本发明公开了人YEATS4基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人YEATS4基因小分子干扰RNA、人YEATS4基因干扰核酸构建体、人YEATS4基因干扰慢病毒并公开了它们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人YEATS4基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中YEATS4基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/867, C12Q1/68, A61K31/713, A61P35/00, C12N15/113
【公开号】CN105648042
【申请号】
【发明人】谭畅, 王小霞, 沈克, 沈浩, 金杨晟, 曹跃琼
【申请人】上海吉凯基因化学技术有限公司
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月12日