FP-YEATS4-siRNA 能 够显著下调YEATS4基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写 为Lv)作为基因操作工具携带RNA i载体pGCS IL-GFP-YEATS4-S i RNA能够靶向地将针对 YEATS4基因的RNAi序列高效导入人结肠癌RK0细胞，降低YEATS4基因的表达水平，显著抑 制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的YEATS4基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床 非手术治疗方式。
[0064] 本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性 抑制人YEATS4基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中 YEATS4基因的表达，促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，进而抑制肿瘤细胞 的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【附图说明】
[0065] 图 1 :pGCSIL_GFP 质粒 DNA 图谱
[0066] 图2 :YEATS4-RNAi慢病毒侵染结肠癌细胞4天后，YEATS4mRNA的表达水平显著降 低
[0067] 图3 :YEATS4_RNAi慢病毒侵染结肠癌细胞4天后，引起细胞增殖抑制
【具体实施方式】
[0068] 本发明涉及了一组针对人YEATS4基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰 载体和RNA干扰慢病毒。选取人YEATS4mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点 中连续的10-30(优选15-27,更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克 隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上 述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源YEATS4基因的表达。
[0069] 本发明的发明人经过广泛而深入的研究发现，在肿瘤组织中，YEATS4基因显著高 表达；发明人发现，采用RNAi方法下调人YEATS4基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增 殖、促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，可以有效地控制肿瘤的生长进程， 这一研究成果表明YEATS4基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和 测试了多种针对YEATS4基因的siRNA，筛选出了可有效抑制YEATS4的表达进而抑制结肠癌 RK0细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
[0070] 本发明提供了一系列干扰人YEATS4基因的小干扰RNA (siRNA)序列，构建了可特 异性沉默YEATS4基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人YEATS4基因设计的小干扰 RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调YEATS4基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增 殖。本发明表明YEATS4基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。 而且，通过RNAi方式沉默YEATS4基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
[0071] 本发明的设计思路为：
[0072] 本发明通过如下方法来筛选获得一种人YEATS4基因 RNAi慢病毒：从Genbank中 调取人YEATS4基因序列；预测siRNA位点；合成针对YEATS4基因的有效的siRNA序列、 两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo ;慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构 建表达YEATS4基因 siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体 (Packing Mix, Sigma-aldrich公司）共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可 制得高效沉默YEATS4基因的慢病毒。
[0073] 基于上述方法，本发明提供了 5个干扰YEATS4基因的有效靶点（具体如SEQ ID NO :1-5所示），构建了特异干扰人YEATS4基因的慢病毒。
[0074] 同时本发明还公开一种人YEATS4基因 RNAi慢病毒（YEATS4-RNAi)及其制备与应 用。
[0075] 本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低YEATS4基因在肿瘤细胞中的表 达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，YEATS4基因是一个原癌基因，可促进肿 瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，YEATS4基因可以为肿瘤治疗的 靶标，慢病毒介导的YEATS4基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
[0076] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制 本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条 件，如[美]Sambr 〇〇k.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0077] 实施例1针对人YEATS4基因 RNAi慢病毒的制备
[0078] 1.筛选针对人YEATS4基因的有效的siRNA靶点
[0079] 从Genbank调取YEATS4基因信息；设计针对YEATS4基因的有效的siRNA靶点。 表1列出了其中5条针对YEATS4基因的有效siRNA靶点序列。
[0080] 表1靶向于人YEATS4基因的siRNA靶点序列
[0081]
[0082]
[0083] 2.慢病毒载体的制备
[0084] 针对siRNA靶点（以SEQ ID N0 :1为例）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点 粘端的双链DNA Oligo序列（表2);以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP 载体（上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切 片段。
[0085] 表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
[0086]
[0087] 通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37°C，反应lh)的载 体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系（连接体系如表5所示）中 于16°C连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态 细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）。在连接转化产物长出菌克 隆表面沾一下，溶于10 μ 1 LB培养基，混匀取1 μ 1作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序 列的上下游，设计通用PCR引物，上游引物序列：5' -CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'（SEQ IDN0:10);下游引物序列 ：5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3'（SEQIDN0:11)，进行PCR鉴 定实验（PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和 比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID N0 :1的表达RNAi的载体，命名为 pGCSIL-GFP-YEATS4-S i RNA。
[0088] 构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'（SEQ ID N0:12)。构建 pGCSIL-GFP-Scr-siRNA 阴性对照质 粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序 列（表3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-YEATS4-siRNA。
[0089] 表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
[0090]
[0092] 通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37°C，反应lh)的载体
[0093] 表4pGCSIL_GFP质粒酶切反应体系
[0094]
[0095] 表5载体DNA和双链双链DNA 01 igo连接反应体系
[0096]
[0097] 表6-1PCR反应体系
[0098]
[0099] 表6-2PCR反应体系程序设定
[0100]
[0101] 3.包装 YEATS4-siRNA 慢病毒
[0102] 以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-YEATS4-siRNA的 DNA，配制成lOOng/μ 1储存液。
[0103] 转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛 血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1. 5 X 105细胞/ml，接种于6孔板，37°C，5 % C02培 养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入 1.5ml 新鲜的完全培养基。按照 Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix 试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix (PVM) 20 μ 1，PEI 12 μ 1，无血清DMEM 培养基400 μ 1，取20 μ 1上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
[0104] 将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基 中，37°C，5% C02培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入 完全培养基2ml。由于慢病毒载体自身带有绿色荧光蛋白的报告基因，24h后可置于荧光 显微镜下观察两组细胞GFP的表达情况，确定慢病毒质粒是否已被293T细胞包装。继续培 养48h后，收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置（Millipore)纯化和浓缩慢 病毒，步骤如下：（1) 4°C，4000g离心10min，除去细