行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得gfp序列，其碱基序列如 SEQIDN0.7所示，所述Gfp-F的碱基序列如SEQIDN0.5所示，所述Gfp-R的碱基序列如SEQ ID NO .6所示； 以所述芽孢杆菌的基因组DNA为模板，以Teminator-F和Teminator-R为引物，进行PCR 扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得下游带Xbal酶切位点的终止 子terminator序列，其碱基序列如SEQ ID NO. 10所示，所述Teminator-F的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，所述Teminator-R的碱基序列如SEQ ID NO.9所示； 步骤2，构建Pxy 1-gfp序列，包括， 步骤2.1，将步骤1中获得的启动子Pxyl序列和gfp序列分别用Xhol单酶切，然后将单酶 切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物和gfp序列的 Xhol单酶切产物； 步骤2.2,将步骤2.1中获得的启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物和gfp序列的Xhol单 酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得连接产物； 步骤2.3，以步骤2.2获得的连接产物为模板，以Pxy 1-F和Gfp-R为引物，进行PCR扩增， 然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得Pxyl-gfp序列； 步骤3，构建Pxyl-gfp-teminator模块序列 步骤3.1，将步骤2.3中获得的Pxyl-gfp序列和步骤1中获得的终止子terminator序列 分别用Bglll单酶切，然后将单酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得Pxyl-gfp序列 的Bgl II单酶切产物和终止子terminator序列的Bgl II单酶切产物； 步骤3.2，将?1}4-8€。序列的1^111单酶切产物和终止子七61'111；[1^1:〇1'序列的1^111单酶 切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得连接产物； 步骤3.3，以步骤3.2获得的连接产物为模板，以Pxyl-F和Teminator-R为引物，进行PCR 扩增，并将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳后胶回收，获得Pxy 1-gf p-teminator模块序列； 步骤4，构建穿梭质粒pPG 步骤4.1，分别将芽孢杆菌表达载体pHY300PLK和步骤3.3获得的Pxyl-gfp-terminator 模块序列经BamHI和Xbal双酶切，然后将双酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得芽 孢杆菌表达载体PHY300PLK的双酶切产物和Pxy Ι-gfp-terminator模块序列的双酶切产物； 步骤4.2，将步骤4.1获得的芽孢杆菌表达载体pHY300PLK的双酶切产物和Pxyl-gfp-terminator模块序列的双酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得穿梭 质粒pPG。4. 根据权利要求3所述的穿梭质粒pPG的制备方法，其特征在于，提取所述芽孢杆菌的 基因组DNA时采用的菌株为枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)。5. 根据权利要求3-4任一项所述的穿梭质粒pPG的制备方法，其特征在于，所述以Pxyl-F和Pxy 1-R为引物，进行PCR扩增的反应体系包括:5yL的10 X PCR缓冲液、lyL的引物Pxyl-F、 lyL的引物Pxyl-R、5yL的芽孢杆菌的基因组DNA、8yL的dNTP、lyL的DNA聚合酶、29yL的 ddH20,反应总体积50yL; 所述以Gf p-F和Gf p-R为引物，进行PCR扩增的反应体系包括:5yL的10 X PCR缓冲液、lyL 的引物Gfp-F、lyL的引物Gfp-R、5yL的质粒pSGl 170、8yL的dNTP、lyL的DNA聚合酶、29yL的 ddH20,反应总体积50yL; 所述以Teminator-F和Teminator-R为引物，进行PCR扩增的反应体系包括：5yL的10 X PCR缓冲液、lyL的引物Teminator-F、lyL的引物Teminator-R、5yL的芽孢杆菌的基因组DNA、 8yL的dNTP、lyL的DNA聚合酶、29yL的ddH 20，反应总体积50yL; 所述PCR扩增的程序均为：第一步，94°C维持4min;第二步，包括30个循环，其中每一个 循环的条件为95°C维持30s、之后55°C维持45s、之后72°C维持lmin;第三步，72°C维持 lOmin;第四步，温度降为4°C，并且PCR程序停止。6. 根据权利要求3-4任一项所述的穿梭质粒pPG的制备方法，其特征在于，步骤2.1的启 动子Pxyl序列用Xhol单酶切的反应体系包括:39yL的启动子Pxyl序列、5yL的10XNEB酶切 缓冲液、2yL的XhoI内切酶、4yL的ddH 20，反应总体积50yL;反应温度37 °C，反应时间2h; 步骤2.1的gf p序列用Xhol单酶切的反应体系包括:39yL的gf p序列、5yL的10 X NEB酶切 缓冲液、2yL的XhoI内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度37 °C，反应时间2h; 步骤3.1的Pxyl-gfp序列用Bglll单酶切的反应体系包括:39yL的Pxyl-gfp序列、5yL的 10 XNEB酶切缓冲液、2yL的BglII内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度37°C，反 应时间2h; 步骤3 · 1的terminator序列用Bgl II单酶切的反应体系包括:39yL的terminator序列、5 yL的10 XNEB酶切缓冲液、2yL的BglII内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度37 °C，反应时间2h。7. 根据权利要求3-4任一项所述的穿梭质粒pPG的制备方法，其特征在于，步骤4.1的芽 孢杆菌表达载体PHY300PLK经BamHI和Xbal双酶切的反应体系包括:37yL的芽孢杆菌表达载 体pHY300PLK、5yL的10XNEB酶切缓冲液、2yL的BamHI内切酶、2yL的Xbal内切酶、4yL的 ddH20，总体积50yL;反应温度37 °C，反应时间2h; 步骤4.1的？171-8€口461'111；[1^1:〇1'模块序列经1^11]1!11和乂&31双酶切的反应体系包括:374 L的Pxyl-gfp-terminator模块序列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的BamHI内切酶、2yL的 Xbal内切酶、4yL的ddH20，总体积50yL;反应温度37°C，反应时间2h。8. 根据权利要求3-4任一项所述的穿梭质粒pPG的制备方法，其特征在于，所述步骤2.2 中，启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物和gfp序列的Xhol单酶切产物经T4DNA连接酶连接的 连接反应体系包括:5yL的启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物、5yL的gf p序列的Xhol单酶切 产物、2yL的10 X T4DNA连接酶缓冲液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的ddH20，反应总体积20yL;反 应温度22°C，反应时间为lh; 所述步骤3.2中，Pxyl-gfp序列的Bglll单酶切产物和终止子terminator序列的Bglll 单酶切产物经T4DNA连接酶连接的连接反应体系包括:5yL的Pxyl-gfp序列的Bglll单酶切 产物、5yL的终止子terminator序列的BglII单酶切产物、2yL的10 XT4DNA连接酶缓冲液、1μ L的T4DNA连接酶、7yL的ddH20，反应总体积20yL;反应温度22 °C，反应时间为lh; 所述步骤4.2中，芽孢杆菌表达载体pHY300PLK的双酶切产物和Pxyl-gfp-terminator 模块序列的双酶切产物经T4DNA连接酶连接的连接反应体系包括:5yL的芽孢杆菌表达载体 PHY300PLK的双酶切产物、5yL的Pxyl-gfp-terminator模块序列的双酶切产物、2yL的10 X T4DNA连接酶缓冲液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的ddH20，反应总体积20yL;反应温度22 °C，反 应时间为lh。9.如权利要求1所述的基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG在芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白 的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG及其制备方法，所述穿梭质粒pPG的碱基序列如SEQ？IN？NO.1所示，所述穿梭质粒pPG的制备方法包括，分别PCR扩增获得启动子Pxyl序列、gfp序列和终止子terminator序列，并以启动子Pxyl序列、gfp序列和终止子terminator序列为材料制备Pxyl-gfp-terminator模块序列，然后将芽孢杆菌表达载体pHY300PLK和Pxyl-gfp-terminator模块序列经BamHI和XbaI双酶切，并将双酶切产物经T4DNA连接酶连接，构建通用的表达芽孢杆菌绿色荧光蛋白的穿梭质粒pPG。本发明穿梭质粒pPG可以转化入宿主菌，实现芽孢杆菌内绿色荧光蛋白的稳定表达，且适用于所有芽孢杆菌。
【IPC分类】C12N15/66, C12N15/65, C12N15/75
【公开号】CN105647955
【申请号】
【发明人】牛秋红, 张 林, 惠丰立, 柯涛, 董冰雪, 韩雪梅
【申请人】南阳师范学院
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月25日