L的ddH20，总体积50yL;反应温度37°C，反应时间2h;
[0034] 步骤4 · 1的Pxyl-gfp-terminator模块序列经BamHI和Xbal双酶切的反应体系包 括:37yL的Pxy 1-gfp-terminator模块序列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的BamHI内切酶、 2yL的Xbal内切酶、4yL的ddH20，总体积50yL;反应温度37°C，反应时间2h;
[0035] 优选的，所述步骤2.2中，启动子?"1序列的乂11〇1单酶切产物和8€?序列的乂11 〇1单 酶切产物经T4DNA连接酶连接的，连接反应体系包括:5yL的Pxy 1序列的Xhol单酶切产物、5μ L的Pxyl序列的Xhol单酶切产物、2yL的10 X T4DNA连接酶缓冲液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的 ddH20，反应总体积20yL;反应温度22 °C，反应时间为lh;
[0036] 所述步骤3.2中，Pxyl-gfp序列的Bglll单酶切产物和终止子terminator序列的 Bglll单酶切产物经T4DNA连接酶连接的连接反应体系包括:5yL的Pxyl-gfp序列的Bglll单 酶切产物、5yL的终止子terminator序列的BglII单酶切产物、2yL的10 X T4DNA连接酶缓冲 液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的ddH20，反应总体积20yL;反应温度22 °C，反应时间为lh;
[0037] 所述步骤4.2中，芽孢杆菌表达载体？阶300?1^的双酶切产物和？1711邝-terminator模块序列的双酶切产物经T4DNA连接酶连接的连接反应体系包括:5yL的芽孢杆 菌表达载体PHY300PLK的双酶切产物、5yL的Pxyl-gfp-terminator模块序列的双酶切产物、 2yL的10 X T4DNA连接酶缓冲液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的ddH20,反应总体积20yL;反应温 度22°C，反应时间为lh。
[0038] 本发明还得第三个目的是提供一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG在芽孢杆菌中表 达绿色荧光蛋白的应用。
[0039] 本发明的有益效果是，本发明提供的穿梭质粒PPG，利用芽孢杆菌表达载体 PHY300PLK，选取芽孢杆菌通用的木糖高效表达的启动子Pxyl，选取gfp基因序列，成功构建 了一种表达芽孢杆菌绿色荧光蛋白的穿梭质粒PPG，将该质粒转化入宿主菌，可实现芽孢杆 菌整个菌体呈现稳定的绿色荧光，适用于所有芽孢杆菌。进一步的，将该质粒转化入宿主 菌，可实现芽孢杆菌整个菌体呈现稳定的绿色荧光，对其分子机制的研究搭建了一个良好 的平台。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明穿梭质粒PPG的构建流程说明图；
[0041] 图2为本发明穿梭质粒PPG可行性验证时短小芽孢杆菌-PPG转化子的荧光显微视 图；
[0042]图3为本发明穿梭质粒pPG可行性验证时枯草芽孢杆菌-pPG转化子的荧光显微视 图；
[0043]图4为本发明穿梭质粒pPG可行性验证时解淀粉芽孢杆菌-pPG转化子的荧光显微 视图。
【具体实施方式】
[0044]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0045]本发明提供一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG，全长5989bp，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，并且所述穿梭质粒pPG具有gfp序列。
[0046]基于同一发明构思，本发明提供了一种穿梭质粒pPG的制备方法，但不应理解为对 本发明的限制。
[0047] 若未特别指明，本发明提供的一种穿梭质粒pPG的制备方法中所用的技术手段为 本领域技术人员所熟知的常规手段，且若本领域技术人员所熟知的常规手段包括一个以上 可供选择的实施方案，则任何一个可供选择的实施方案都不会对本发明的结果造成影响。
[0048] 实施例中短小芽孢杆菌感受态细胞的制备与转化、枯草芽孢杆菌感受态细胞的制 备与转化、解淀粉芽孢杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、 DNA片段的回收、线性DNA片段的连接、PCR扩增反应等参照金冬雁、黎梦楓等译《分子克隆实 验指南》第二版相关章节进行。
[0049] 如图1所示，本发明实施例一种穿梭质粒pPG的制备方法，包括以下步骤：
[0050] 步骤1，获得上游带BamHI的启动子Pxyl序列
[00511步骤1.1，从江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心(CICIM-CU)购买枯草 芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)菌株，并提取该菌株的基因组DNA;
[0052] 步骤1 .2,以步骤1 . 1中获得的基因组DNA为模板，以的Pxyl-F(5'_ cgcggatcccatttccccctttgatttttag-3 '）^PPxyl-R(5'-ccgctcgagtcctttgtttatccaccgaac-3'）为引物，进行PCR扩增，所述Pxyl-F的碱基序列如 SEQIDN0.2，所述Pxyl-R的碱基序列如SEQIDN0.3所示；
[0053] 步骤1.3,将步骤1.2中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，之后进行胶回收，获得上 游带BamHI的启动子Pxyl序列，总长为285bp，其碱基序列如SEQ ID N0.4所示。
[0054] 步骤2,获得gfp序列
[0055] 步骤2· 1，从Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)购买含gfp的质粒pSG1170， 并以质粒pSG1170为模板，以Gfp_F(5'-ccgctcgaggtggttattattcaaattgc-3'）和6€口-1?(5'-ggaagatctgagattttctagttcagtcag-3 '）为引物，进行PCR扩增，Gfp-F的碱基序列如SEQ ID N0.5所示，所述Gfp-R的碱基序列如SEQIDN0.6所示；
[0056] 步骤2.2,将步骤2.1中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，之后进行胶回收，获得全 长为789bp的gfp基因，其碱基序列如SEQIDN0.7所示。
[0057] 步骤3，PCR扩增获得下游带Xbal的终止子terminator序列
[0058] 步骤3. 1，以步骤1 . 1中获得的基因组DNA为模板，以Teminator-F(5'_ ggaagatctacgttcttgccattgctgc-3 '）^PTeminator-R(5'-ctagtctagatcgatatctctgcagtcgcgatgatt-3'）为引物，进行PCR扩增，所述Teminator-F的 碱基序列如SEQ ID NO.8所示，所述Teminator-R的碱基序列如SEQ ID NO.9所示；
[0059]步骤3.2,将步骤3.1中的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，之后进行胶回收，获得下 游带Xbal的终止子terminator序列，总长为105bp，其碱基序列如SEQ ID N0.10所示。
[0000] 步骤4,构建Pxyl-gfp序列，包括，
[00611步骤4.1，将步骤1中获得的启动子Pxyl序列和gfp序列分别用Xhol单酶切，然后将 单酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物和gfp序 列的Xhol单酶切产物；
[0062] 步骤4.2，将步骤4.1中获得的启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物和gfp序列的 Xho I单酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得连接产物；
[0063] 步骤4.3，以步骤4.2获得的连接产物为模板，以Pxyl-F和Gfp-R为引物，进行PCR扩 增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得Pxyl-gfp序列；
[0064] 步骤 5，构建 Pxy l-gfp-teminator 模块序列
[0065] 步骤5. 1，将步骤4.3中获得的Pxyl-gfp序列和步骤1 .3中获得的终止子 terminator序列分别用Bgl II单酶切，然后将单酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获 得Pxyl-gfp序列的Bgl II单酶切产物和终止子terminator序列的Bgl II单酶切产物；
[0066] 步骤5.2,将步骤5. 1中获得的Pxyl-gfp序列的Bglll单酶切产物和终止子 terminator序列的Bgl II单酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得连 接产物；
[0067] 步骤5.3，以步骤5.2获得的连接产物为模板，以Pxyl-F和Teminator-R为引物，进 行PCR扩增，并将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳后胶回收，获得Pxyl-gfp-teminator模块序 列；
[0068] 步骤6,构建穿梭质粒pPG
[0069] 步骤6.1，分别将所述芽孢杆菌表达载体pHY300PLK和步骤5.3获得的PXyl-gfp-t erminat0r模块序列经BamHI和XbaI双酶切，然后将双酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回 收，获得芽孢杆菌表达载体PHY300PLK的双酶切产物和Pxyl-gfp-terminator模块序列的双 酶切产物；
[0070] 步骤6.2