，将步骤4.1获得的芽孢杆菌表达载体?!^300?1^的双酶切产物和？"1-gfp-terminator模块序列的双酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得 穿梭质粒pPG。
[0071 ]需要说明的是，步骤1.2、步骤2.1、步骤3.1中的PCR扩增反应体系和程序采用本领 域常规手段均可以达到效果，下面提供一种优选的PCR扩增条件：
[0072] 步骤1.2的PCR扩增反应体系包括:5yL的10 X PCR缓冲液、lyL的引物Pxyl-F、lyL的 引物Pxyl_R、5yL的芽孢杆菌的基因组DNA 8yL的dNTP、lyL的DNA聚合酶、29yL的ddH20,反应 总体积50yL;
[0073] 步骤2.1的PCR扩增的反应体系包括:5yL的10 X PCR缓冲液、lyL的引物Gfp-F、lyL 的引物Gf p-R、5yL的质粒pSGl 170、8yL的dNTP、lyL的DNA聚合酶、29yL的ddH20，反应总体积 50yL；
[0074] 步骤3 · 1的PCR扩增的反应体系包括:5yL的10 XPCR缓冲液、lyL的引物Teminator- F、lyL的引物Teminator-R、5yL的芽孢杆菌的基因组DNA、8yL的dNTP、lyL的DNA聚合酶、29yL 的ddH20，反应总体积50yL;
[0075] 步骤1.2、步骤2.1、步骤3.1中的PCR扩增的程序均为:第一步，94°C维持4min;第二 步，包括30个循环，其中每一个循环的条件为95°C维持30s、之后55°C维持45s、之后72°C维 持lmin;第三步，72°C维持lOmin;第四步，温度降为4°C，并且PCR程序停止。
[0076] 需要说明的是，步骤4.1、步骤5.1和步骤6.1中的酶切反应体系、反应温度和反应 时间采用本领域常规手段均可以达到效果，下面提供一种优选的酶切反应条件：
[0077] 步骤4.1的启动子Pxyl序列用Xhol单酶切的反应体系包括:39yL的启动子Pxyl序 列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的Xhol内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度 37°(：，反应时间211;
[0078] 步骤4.1的gfp序列用Xhol单酶切的反应体系包括:39yL的gfp序列、5yL的10 X NEB 酶切缓冲液、2yL的XhoI内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度37 °C，反应时间2h;
[0079] 步骤5.1中的Pxyl-gfp序列用Bglll单酶切的反应体系包括：39yL的Pxyl-gfp序 列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的Bgl II内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度 37°(：，反应时间211;
[0080] 步骤5 · 1的terminator序列用Bglll单酶切的反应体系包括:39yL的terminator序 列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的Bgl II内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度 37°(：，反应时间211。
[0081 ] 所述步骤6.1的芽孢杆菌表达载体pHY300PLK经BamHI和Xbal双酶切的反应体系包 括:37yL的芽孢杆菌表达载体pHY300PLK、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的BamHI内切酶、2μ L的Xbal内切酶、4yL的ddH20，总体积50yL;反应温度37°C，反应时间2h;
[0082] 步骤6 · 1的Pxyl-gfp-terminator模块序列经BamHI和Xbal双酶切的反应体系包 括:37yL的Pxy 1-gfp-terminator模块序列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的BamHI内切酶、 2yL的Xbal内切酶、4yL的ddH20，总体积50yL;反应温度37°C，反应时间2h。
[0083] 需要说明的是，步骤4.2、步骤5.2和步骤6.2中的连接反应体系、反应温度和反应 时间采用本领域常规手段均可以达到效果，下面提供一种优选的连接反应条件：
[0084] 所述步骤4.2中，启动子?"1序列的乂11〇1单酶切产物和8€?序列的乂11 〇1单酶切产物 经T4DNA连接酶连接的连接反应体系包括:5yL的启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物、5yL的 gfp序列的Xhol单酶切产物、2yL的10XT4DNA连接酶缓冲液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的 ddH20，反应总体积20yL;反应温度22 °C，反应时间为lh;
[0085] 所述步骤5.2中，Pxyl-gfp序列的Bglll单酶切产物和终止子terminator序列的 Bglll单酶切产物经T4DNA连接酶连接的连接反应体系包括:5yL的Pxyl-gfp序列的Bglll单 酶切产物、5yL的终止子terminator序列的BglII单酶切产物、2yL的10 X T4DNA连接酶缓冲 液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的ddH20，反应总体积20yL;反应温度22 °C，反应时间为lh;
[0086] 所述步骤6.2中，芽孢杆菌表达载体？阶300?1^的双酶切产物和？1711邝-terminator模块序列的双酶切产物经T4DNA连接酶连接的连接反应体系包括:5yL的芽孢杆 菌表达载体PHY300PLK的双酶切产物、5yL的Pxyl-gfp-terminator模块序列的双酶切产物、 2yL的10 X T4DNA连接酶缓冲液、lyL的T4DNA连接酶、7yL的ddH20,反应总体积20yL;反应温 度22°C，反应时间为lh。
[0087] 需要说明的是，所述 Pxyl-F、Pxyl-R、Gfp-F、Gfp-R、TeminatorH^PTeminator-I^9 碱基序列由TakaRa公司合成，本发明所使用的内切酶包括XhoI、Bglll、BamHI和Xbal，均购 自TakaRa公司，本发明所使用的其他实验材料均购自均购自TakaRa公司。
[0088]需要说明的是，所述Pxyl序列和gfp序列上分别只有一个Xhol酶切位点，所述 Pxyl-gfp序列和终止子terminator序列上分别只有一个Bglll酶切位点，所述Pxyl-gfp-terminator模块序列上的BamHI和Xbal酶切位点分别只有一个，所述芽孢杆菌表达载体 PHY300PLK上的BamHI和Xba頂每切位点也分别只有一个。
[0089]本发明提供的穿梭质粒pPG，利用芽孢杆菌表达载体pHY300PLK，选取芽孢杆菌通 用的木糖高效表达的启动子Pxyl，选取gfp基因序列，成功构建了一种通用的表达芽孢杆菌 绿色荧光蛋白的穿梭质粒PPG，将该质粒转化入宿主菌，可实现芽孢杆菌整个菌体呈现稳定 的绿色荧光，适用于所有芽孢杆菌。进一步的，将该质粒转化入宿主菌，可实现芽孢杆菌整 个菌体呈现稳定的绿色荧光，对其分子机制的研究搭建了一个良好的平台。
[0090] 进一步的，选取了本领域实验中常见的短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽 孢杆菌进行可行性验证，包括以下步骤：
[0091] 分别制备短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的感受态细胞;将构建 好的穿梭质粒PPG分别在短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的感受态细胞中 进行转化，即分别构建短小芽孢杆菌-PPG转化子、枯草芽孢杆菌-pPG转化子和解淀粉芽孢 杆菌-PPG转化子;将短小芽孢杆菌-pPG转化子、枯草芽孢杆菌-pPG转化子和解淀粉芽孢杆 菌-PPG转化子分别置于荧光显微镜下观察。结果表明：图2、3和4分别为短小芽孢杆菌-pPG 转化子、枯草芽孢杆菌-pPG转化子和解淀粉芽孢杆菌-pPG转化子的荧光显微视图，结果表 明，各个转化子在荧光显微镜下均可观察到明显的荧光标记效果，说明本发明穿梭质粒PPG 在各芽孢杆菌细胞中均可表达，具有较好的通用性。
[0092] 本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和 范围，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本 发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1. 一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所 述穿梭质粒pPG具有gfp序列。2. 根据权利要求1所述的穿梭质粒pPG，其特征在于，所述穿梭质粒pPG以枯草芽孢杆菌 168 (Bacillus subtil is 168)菌株、质粒pSGl 170、芽抱杆菌表达载体pHY300PLK为原料制 备而成。3. -种权利要求1所述的穿梭质粒pPG的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，获得启动子Pxyl序列、gfp序列和终止子terminator序列，包括： 提取芽孢杆菌的基因组DNA，并以所述芽孢杆菌的基因组DNA为模板，以Pxy 1-F和Pxy 1 -R为引物，进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得上游带 BamHI酶切位点的启动子Pxyl序列，其碱基序列如SEQ ID勵.4所示，所述?"14的碱基序 列如SEQIDN0.2所示，所述Pxyl-R的碱基序列如SEQIDN0.3所示 ； 购买含gf P序列的质粒PSG1170，并以质粒pSGl 170为模板，以Gf p-F和Gf p-R为引物，进