一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG、制备方法 及其应用。
【背景技术】
[0002] 芽孢杆菌在自然界中多样性丰富、分布广，具有耐高温高压、抗逆性强、易储存等 生物特性，广泛应用于农业、工业、食品、饲料和医药等行业。芽胞杆菌能够产生很多重要的 生物活性物质，还可以抑制多种植物病原菌;利用芽胞杆菌制成的微生态饲料添加剂具有 增加饲料利用率、提高动物生产性能、促进机体免疫、促进动物胃肠道微生态平衡及抗菌防 病等功效。鉴于芽孢杆菌的重要性以及分子克隆技术的日渐成熟，若能够对芽孢杆菌进行 荧光标记，实现实时跟踪，将对芽孢杆菌研究到分子水平，可以加深对芽孢杆菌分子作用机 理的认识。
[0003] 现有技术中，常用的方法是针对特定的芽孢杆菌，选择其中特定的看家基因，比如 细胞形态维持蛋白基因 mreB，然后在看家基因的碳末端融合表达绿色焚光蛋白（green fluorescent protein，gfp)，实现gfp组成型表达菌株。然而，由于不同的芽孢杆菌基因存 在特异性，每换一种菌株都得重新构建质粒，缺乏质粒应用的广泛性，增加了构建能够稳定 且高水平表达gfp的芽孢杆菌菌株的难度。
[0004] 综上，现有技术中存在的问题是，现有的应用于芽孢杆菌的表达gfp的质粒缺乏广 泛性、通用性。
【发明内容】
[0005] 本发明实施例的目的是提供一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG、制备方法及其应 用，用以解决现有的应用于芽孢杆菌的表达gfp的质粒缺乏广泛性、通用性的问题。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG，其碱基序列如SEQ ID NO. 1所示，所述穿梭质粒pPG具有gfp序列。
[0007] 优选的，所述穿梭质粒pPG以枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)菌株、质 粒pSGl 170、芽孢杆菌表达载体pHY300PLK为原料制备而成。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种基于芽孢杆菌的穿梭质粒pPG的制备方法，包括 以下步骤：
[0009] 步骤1，获得启动子Pxyl序列、gfp序列和终止子terminator序列，包括：
[0010] 提取芽孢杆菌的基因组DNA，并以所述芽孢杆菌的基因组DNA为模板，以Pxyl-F和 Pxyl-R为引物，进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得上游 带BamM酶切位点的启动子Pxy 1序列，其碱基序列如SEQ ID N0.4所示，所述Pxy 1-F的碱基 序列如SEQ ID N0.2所示，所述Pxyl-R的碱基序列如SEQ ID N0.3所示；
[0011] 购买含gf P序列的质粒pSGl 170，并以质粒pSGl 170为模板，以Gfp-F和Gf p-R为引 物，进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得gfp序列，其碱基 序列如SEQIDN0.7所示，所述Gfp-F的碱基序列如SEQIDN0.5所示，所述Gfp-R的碱基序 列如SEQ ID NO.6所示；
[0012] 以所述芽孢杆菌的基因组DNA为模板，以Teminator-F和Teminator-R为引物，进行 PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得下游带Xbal酶切位点的终 止子terminator序列，其碱基序列如SEQ ID NO. 10所示，所述Teminator-F的碱基序列如 SEQ ID NO.8所示，所述Teminator-R的碱基序列如SEQ ID NO.9所示；
[0013] 步骤2,构建Pxyl-gfp序列，包括：
[0014]步骤2.1，将步骤1中获得的启动子Pxyl序列和gfp序列分别用Xhol单酶切，然后将 单酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物和gfp序 列的Xhol单酶切产物；
[0015] 步骤2.2,将步骤2.1中获得的启动子Pxyl序列的Xhol单酶切产物和gfp序列的 Xho I单酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得连接产物；
[0016] 步骤2.3，以步骤2.2获得的连接产物为模板，以Pxy 1-F和Gfp-R为引物，进行PCR扩 增，然后将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得Pxyl-gfp序列；
[0017] 步骤 3，构建 Pxy l-gfp-teminator 模块序列
[0018] 步骤3 · 1，将步骤2.3中获得的Pxyl-gfp序列和步骤1中获得的终止子terminator 序列分别用Bglll单酶切，然后将单酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回收，获得Pxyl-gfp 序列的Bgl II单酶切产物和终止子terminator序列的Bgl II单酶切产物；
[0019] 步骤3 · 2，将Pxyl-gfp序列的Bglll单酶切产物和终止子terminator序列的Bglll 单酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得连接产物；
[0020] 步骤3.3，以步骤3.2获得的连接产物为模板，以Pxyl-F和Teminator-R为引物，进 行PCR扩增，并将PCR扩增产物进行琼脂糖电泳后胶回收，获得Pxyl-gfp-teminator模块序 列；
[0021] 步骤4，构建穿梭质粒pPG
[0022] 步骤4.1，分别将所述芽孢杆菌表达载体pHY300PLK和步骤3.3获得的PXyl-gfp-terminat 0r模块序列经BamHI和XbaI双酶切，然后将双酶切产物进行琼脂糖电泳，最后胶回 收，获得芽孢杆菌表达载体PHY300PLK的双酶切产物和Pxyl-gfp-terminator模块序列的双 酶切产物；
[0023] 步骤4.2，将步骤4.1获得的芽孢杆菌表达载体?!^300?1^的双酶切产物和？"1-gfp-terminator模块序列的双酶切产物经T4DNA连接酶连接，然后经琼脂糖电泳回收，获得 穿梭质粒pPG。
[0024] 优选的，提取所述芽孢杆菌的基因组DNA时采用的菌株为枯草芽孢杆菌168 (Bacillus subtilis 168)；
[0025] 优选的，所述以Pxyl-F和Pxyl-R为引物，进行PCR扩增的反应体系包括:5yL的10 X PCR缓冲液、lyL的引物Pxyl-F、lyL的引物Pxyl-R、5yL的芽孢杆菌的基因组DNA、8yL的dNTP、 lyL的DNA聚合酶、29yL的ddH20，反应总体积50yL;
[0026] 所述以Gfp-F和Gfp-R为引物，进行PCR扩增的反应体系包括：5yL的10 X PCR缓冲 液、lyL 的引物Gf p-F、lyL 的引物Gf p-R、5yL 的质粒pSGl 170、8yL 的 dNTP、lyL 的 DNA聚合酶、29 yL的ddH20，反应总体积50yL;
[0027] 所述以Teminator-F和Teminator-R为引物，进行PCR扩增的反应体系包括:5yL的 10 X PCR缓冲液、lyL的引物Teminator-F、lyL的引物Teminator-R、5yL的芽孢杆菌的基因组 DNA、8yL 的 dNTP、lyL 的 DNA 聚合酶、29yL 的 ddH20，反应总体积 50yL;
[0028] 所述PCR扩增的程序均为：第一步，94°C维持4min;第二步，包括30个循环，其中每 一个循环的条件为95 °C维持30s、之后55 °C维持45s、之后72 °C维持lmin;第三步，72 °C维持 lOmin;第四步，温度降为4°C，并且PCR程序停止；
[0029] 优选的，步骤2.1的启动子Pxyl序列用Xhol单酶切的反应体系包括:39yL的启动子 Pxy 1序列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的Xhol内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反 应温度37°C，反应时间2h;
[0030] 步骤2.1的gfp序列用Xhol单酶切的反应体系包括:39yL的gfp序列、5yL的10XNEB 酶切缓冲液、2yL的XhoI内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度37 °C，反应时间2h; [0031 ] 步骤3.1的Pxyl-gfp序列用Bglll单酶切的反应体系包括:39yL的Pxyl-gfp序列、5 yL的10 XNEB酶切缓冲液、2yL的BglII内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度37 °C，反应时间2h;
[0032] 步骤3 · 1的terminator序列用Bglll单酶切的反应体系包括:39yL的terminator序 列、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的Bgl II内切酶、4yL的ddH20，反应总体积50yL;反应温度 37°(：，反应时间211;
[0033] 优选的，步骤4.1的芽孢杆菌表达载体pHY300PLK经BamHI和Xbal双酶切的反应体 系包括:37yL的芽孢杆菌表达载体pHY300PLK、5yL的10 X NEB酶切缓冲液、2yL的BamHI内切 酶、2yL的Xbal内切酶、4y