μL
[0274] ........ ATP 溶液 （).8 μL
[0275] 反应条件：消化30 Γ 30分钟，酶灭活70 Γ 30分钟；
[0276] 滚环扩增反应
[0277] 反应中所用的引物R1~R8见下表，均为HBV基因保守区序列，
[0278] 表 5.RCA 引物
[0279]
[0280] ~在反应前配制成引物混合溶液，反应步骤如下: ' '
[0281] 反应体系 l〇xPhi29 DNA 聚合酶 Buffer ΙμL 引物（R1 ~ R8 mix) 4μ1 ( ΙΟμΜ)
[0282] DNA模板 适量（~5μ1) ddH20 补足至10μ1 总体积 10 μL
[0283] 反应混合物经如下过程逐步降温 95 V 3分钟 50 °C 15 s
[0284] 3?? 15 s 20 V 10分钟
[0285] 置于冰上，再在如下体系中反应： 反应混合物 10μ1 Phi29 DNA 聚合酶 1 μL (10 μ/μL) H)xPhi29 DNA 聚合酶 Buffer ΙμL
[0286] 引物(R卜 R8 mix) 4μ1 (ΙΟμΜ) BSA ΙμL (0.4 mg/nil) 4><dNTP mix 3μ1 (10 in Μ) 总体积 20μ1
[0287] 将混合反应液置于30°C水浴中，过夜反应16小时，取出产物，置于65 °C水浴10分 钟，以灭活Phi 29DNA聚合酶。
[0288] A1AT检测细胞染色体DNA污染
[0289] 分别用A1AT基因特异性引物和HBS特异性引物对PSAD消化产物进行扩增检测
[0290] 引物名称序列(5'-3'）
[0291] A1AT-F TTCCCTGGTCTGAATGTGTG
[0292] A1AT-R ACTGTCCCAGGTCAGTGGTG
[0293] HBSF TCACAATACCGCAGAGTC
[0294] HBSR ACATCCAGCGATAACCAG 体系：模板 2μ1 PF 2μ1 PR 2μ1 Ex Taq ( Takara) 1 μL
[0295] l()xEx Buffer 5μ1 dNTPs 8 ul .t: ddH20 30 μΙ 最终体系 50μ1 反应条件：95°C 10分钟 95 °C 30 秒
[0296] 60V 30秒 30个循环 72V 30 秒 72°C 10分钟
[0297] 4°C +〇0
[0298] 扩增结果见图13,结果显示，提取的cccDNA用HBV特异性引物扩增出相应条带，而 用染色体特异引物则未见扩增条带。提示提出的cccDNA中不含有染色体DNA的污染。
[0299] 跨缺口荧光定量PCR。内参基因 β-actin同时扩增，原始DNA模板量ΙμL，不足体积由 双蒸水补足。扩增引物及探针序列(表6)。
[0300] 表6. cccDNA及内参检测的探针和引物
[0301]
滚环扩增产物 3μ1 引物(各 0·5μ1><2) 1 μL 探针 cccProbe 0,5μ1 10χBuffer 2.5 μL
[0303] 10xMgC12 2.5 μL IDKdNTP 5 μL Taq 0.5 μL ddH20 10 μL
[0304] 反应条件：94 °C 3 分钟，94 °C 30 秒，58 °C 45 秒 X 40。
[0305] HBV cccDNA定量检测结果见图14,结果显示，S4位点突变的细胞株中连续9天培养 后HBV cccDNA的含量相比对照组降低了95.37 ±0.64%。
[0306] e、免疫荧光（IF)检测细胞内乙肝表面抗原
[0307] 1)细胞准备(S4位点突变株T11和对照株N1)。在传代培养时，将细胞接种到预先放 置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；
[0308] 2)固定，根据需要选择适当的固定剂固定细胞。PBS洗涤3 X 5分钟。
[0309] 3)通透，使用0.5%Triton X100通透20分钟。通透后用PBS洗涤3X5分钟。
[0310] 4)封闭，使用封闭液(碧云天)对细胞进行封闭30分钟。
[0311] 5)-抗结合，小鼠源抗HBsAg抗体(Abeam) 1: 200稀释，室温孵育lh或者4°C过夜。 PBST漂洗3次，每次冲洗5分钟。
[0312] 6)二抗结合，FITC羊抗鼠二抗(康为世纪）室温避光孵育lhWBST漂洗3次，每次冲 洗5分钟后，再用蒸馏水漂洗一次。
[0313] 7)封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
[0314] 检测结果见图15A和B，其中A图显示，相比对照组S4位点产生突变的单克隆细胞株 中细胞内HBsAg含量明显下降，B图通过量化后显示S4位点突变的细胞株中连续9天培养后 细胞内HBsAg的含量相比对照组降低了82.86 ±4.01 %。
[0315] 2、检测S4位点突变后细胞内不同状态HBV DNA的突变情况（图16A)
[0316] a、PCR扩增整合状态的HBV DNA
[0317] 1)引物的设计：
[0318]根据构建HepG.A64细胞系的pTriexHBVl. 1质粒中HBV的侧翼序列设计特异性引物 (图16B，C，B图为整合状态HBV DNA的示意图；C图为构建HBV稳转细胞系HepG2.A64时使用的 HBV质粒示意图）：
[0319] 正向：A64F 5，CGCTCCGAAAGTTTCCTT 3，
[0320] 反向：A64R 5'CGCTCTAACATACCACCCTAAA3'
[0321] 2汗0財广增〇&1?5瓜）：
[0322]
[0323]
[0324]
[0325] 扩增结果见图16D，利用特异性引物成功扩增出1.1倍整合状态HBV DNA及两端侧 翼序列，约为4000bp。
[0326] 为确认引物A64F和A64R扩增产物为染色体基因组中整合状态的HBV DNA，而非游 离状态下的HBV DNA，使用PSAD消化后的细胞DNA为模版，用引物A64F、A64R和HBV特异性引 物HBSF、HBSR进行扩增，结果证实了引物A64F、A64R扩增整合状态HBV DNA的特异性，结果见 图16F。结果显示，A64F和A64R扩增产物为染色体基因组中整合状态的HBV DNA，而非环状的 HBV DNA。
[0327] 在分别扩增得到HBV总DNA、HBV复制中间体DNA、HBV cccDNA和整合状态的HBV DNA 之后，利用引物S4-F、S4-R(引物序列见表2)进行测序，发现S4位点突变的HBV稳转细胞中 HBV总DNA、HBV cccDNA和整合状态的HBV DNA均在S4位点处发生了缺失插入突变，而核心颗 粒中的HBV DNA序列未见明显改变，测序结果见图16A。结果显示，S4位点突变的HBV稳转细 胞中HBV总DNA、HBV cccDNA和整合状态的HBV DNA均在S4位点处发生了缺失插入突变，而核 心颗粒中的HBV DNA序列未见明显改变。
[0328] 实施例4: gRNA-S4抑制HBV高压水动力小鼠模型中HBV复制与表达
[0329] a、选取4-6周龄的C57BL/6小鼠 10只，分成两组，每组各5只，其中实验组同时注射 含有1.2倍长度的HBV基因质粒pGL3-HBVl. 2和CRISPR质粒gRNA-S4各1 Oug，对照组同时注射 含有1.2倍长度的HBV基因质粒pGL3-HBVl. 2和CRISPR对照质粒gRNA-空白各10ug(图18A)。 具体方法如下：
[0330] (1)将小鼠放在金属笼或鼠夹中，通过金属笼或鼠夹的孔拉出尾巴，用左手抓住小 鼠尾巴中部。
[0331] (2)采用左右两侧的静脉进行注射，拔去沿尾部静脉走向的毛，置尾巴于45~50°C 温水中浸泡几分钟或用75%酒精棉球反复擦拭尾部，以达到消毒和使尾部血管扩张及软化 表皮角质的目的。
[0332] (3)以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉更为充盈，用中指从下面托起尾巴， 以无名指夹住尾巴的末梢，右手持4号针头注射器，使针头与静脉平行(小于30°角），从尾巴 的下1/4处进针，开始注入药物时应缓慢，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已 刺入血管，可正式注入药物。拔出针头后，用拇指按住注射部位轻压1~2分钟，防止出血。
[0333] (4)分别于注射后的第1天，第3天，第5天和第7天对10只小鼠进行眼眶静脉丛取 血，随后定量检测两组小鼠血清中HBV表面抗原和HBV DNA含量的变化。
[0334] b、检测小鼠血清中HBV表面抗原的含量
[0335] 使用罗氏诊断EleCSyS?HBsAg II定量检测方法检测注射后的第1天，第3天，第5 天和第7天小鼠血清中的乙肝表面抗原（图18B)。结果显示，相比注射gRNA-空白的小鼠，注 射8尺祖-34的小鼠血清中的乙肝表面抗原从平均23504±3065 11]/1111降至18.93±9.50 11]/ ml，降低 99·91±0·05%。
[0336] c、检测小鼠血清中HBV DNA(鑫诺美迪HBV DNA荧光定量检测试剂盒）
[0337] 取出试剂盒中组分，室温放置，待其充分溶解后混匀并瞬时离心；
[0338] 根据待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性指控品、HBV定量标准品I~IV的数量 按以下比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备PCR-mix，混匀并瞬时离心备用。
[0339] HBV PCR反应液 30
[0340] HBV酶混合物 1.5
[0341] 取3μ 1核酸释放剂，加入PCR反应管中。分别取待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界 阳性质控品、HBV定量标准品I~IV各3μ1加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打 混匀3-5次，静置5分钟；
[0342] 反应条件：
[0343]
注射后的第1天，第3天，第5天和第7天小鼠血清中HBV DNA的检测结果见图18C，结 果显示，相比注射gRNA-空白的小鼠，注射5天后gRNA-S4的小鼠血清中的HBV DNA从49905 土 19417IU/ml 降至 202±200IU/ml(n = 5)。
【主权项】
1. 一种gRNA序列，所述序列在CRISPR-Cas9系统中能够以乙肝病毒基因组S基因保守区 域位点为靶序列进行DNA序列的编辑，所述靶序列存在一个原间区毗邻序列CGG。2. 根据权利要求1所述的gRNA序列，其特征在于，所述gRNA序列如SEQ ID N0:2所示。3. -种含有权利要求1或2所述gRNA序列的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述gRNA序 列与能表达Cas9蛋白的表达载体相连接。4. 根据权利要求3所述的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述载体为质粒卩1459_ pSpCas9(BB)-2A-Puro〇5. 根据权利要求4所述的CRISPR-Cas9系统，其特征在于，所述连接为，先在所述gRNA的 5 '端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5 '端加上AAAC，之后再与所述质粒连 接。6. 根据权利要求5所述的CRISPR-Cas9系统在制备治疗乙肝药物中的应用。7. -种含有权利要求5所述系统的组合物，其特征在于，所述组合物还含有制药学上可 接受的载体。8. 根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物被制备为注射剂。
【专利摘要】本发明公开了一种gRNA序列，所述序列在CRISPR-Cas9系统中能够以乙肝病毒基因组S基因保守区域位点为靶序列进行DNA序列的编辑，并在HBV稳转细胞模型、HBV水动力小鼠模型中均成功破坏HBV？cccDNA和整合状态的HBV？DNA，并取得显著的抑制HBV复制与表达的效果。本发明还提供了含有上述gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备治疗乙肝药物中的应用。
【IPC分类】A61K31/713, C12N15/63, A61P1/16, A61K48/00, A61P31/20, C12N15/113
【公开号】CN105647922
【申请号】
【发明人】宋宏彬, 邱少富, 李 浩, 刘鸿博, 生春雨, 李鹏, 戚丽华, 王立贵, 谢靖, 贾雷立, 郝荣章, 苏文莉
【申请人】中国人民解放军疾病预防控制所
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年1月11日