基于一种新gRNA序列的CRISPR-Cas9系统在制备乙肝治疗药物中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种gRNA序列及通过CRISPR_Cas9系统对乙肝病毒进行基因编辑的技 术，属于基因突变和基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)引起的严重传染性疾 病。全球共有20亿人感染过乙肝病毒，其中约4亿人为乙肝病毒慢性感染者，HBV持续感染会 导致其中部分患者恶化为肝硬化甚至肝癌，每年死于HBV引起的肝脏相关疾病的人数达到 一百万人。我国是乙肝大国，现有HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万 例。每年用于乙肝治疗的直接费用超过1000亿元，乙肝病毒感染已经成为危害公众健康的 重大问题。虽然目前乙肝疫苗已广泛应用，在一定程度上预防了HBV新发感染，降低了乙肝 发病率。但对于慢性HBV感染者，仍需通过有效的抗病毒治疗来缓解病情、延缓或阻断肝硬 化进程、防止出现肝衰竭或肝细胞癌变等严重后果。目前，常用的乙肝抗病毒治疗药物有干 扰素和核苷类似物等。干扰素（Interferon，IFN)具有直接的抗病毒和免疫调节作用并可有 效提高机体免疫力，但干扰素治疗有严格的适应证和禁忌证，适于干扰素的患者仅1/3获得 持续应答，而且副作用较多。核苷类似物(Nucleostide Analogues，NAs)可通过抑制DNA逆 转录酶活性从而抑制乙肝病毒的复制，然而，乙肝患者在口服NAs抗病毒治疗过程中会出现 诸多问题:疗程难以确定，大多数患者需要长期治疗甚至终身治疗，而随着治疗时间的延 长，产生HBV耐药性突变的风险也随之增加。重要的是，肝细胞内共价闭合环状DNA(cccDNA) 的持续存在是HBV慢性感染和复发的根源。此外，HBV在复制过程中还能够与细胞基因组进 行整合，而这种整合改变了内源性基因的功能或者染色体不稳定，从而诱导肝细胞癌的发 生。长期以来，一直未能找到以cccDNA和整合的HBV DNA为靶点的药物或其他治疗方法。NAs 虽然能明显抑制病毒复制水平，使病毒DNA含量下降或消失，但由于肝细胞核内产生新病毒 的根源(病毒复制模板cccDNA)未能根除，即使患者在达到治疗终点后停药，残存的病毒也 可能以cccDNA为模板再次大量复制，激发强烈的免疫应答，导致短期内广泛肝组织损伤，病 情复发，严重者可以导致重型肝炎或肝衰竭。
[0003] 近年来出现的DNA编辑技术可以对任何物种进行DNA的精确编辑，使得从根本上清 除cccDNA和整合的HBV DNA成为了可能。目前主要的基因编辑技术包括:锌指核酸酶(Zinc Fingernucleases，ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶（Transeription Aetivator-like Effector Nueleases，TALENs)和成簇的规律间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)/Cas9系统。Thomas J Cradick等构建了针对HBV C基因的ZFNs系统，并使得HBV前基因组RNA(pgRNA)降低了约 29%，Bloom K等利用TALENs有效干扰相应的HBV靶序列并抑制了病毒的复制，在 HepG2.2.15中，经过3次转染，导致约35 %的cccDNA发生突变，在水动力法转染HBV小鼠模型 体内也显著抑制了病毒复制。然而ZFNs和TALENs系统组装与筛选复杂，存在细胞毒性、易脱 靶、构建成本偏高等问题，加之TALENs可能引起的免疫反应限制了其应用和发展。CRISPR-Cas9技术的出现有望克服上述不足，实现从根本上破坏或清除HBV的目标。
[0004] CRISPR系统是新发现的原核生物获得性免疫机制。2012年Matthew等在II型 CRISPR系统中发现了一种双链RNA，并将这种双链RNA改造为一种能指导Cas9蛋白对几乎所 有DNA序列进行剪切的工具，即一种全新的基因定点改造技术一一CRISPR-Cas9编辑技术， 随后Naure、Science、Cell等权威期刊竞相报道其最新研究进展。Nature杂志将CRISPR-Cas9编辑技术评为过去十年对生物学研究影响最深的十大技术之一，Science、MIT Technology Review等杂志也将其评为2014年十大突破性技术。CRISPR_Cas9编辑技术仅需 设计sgRNA就可实现对含有原间区峨邻序列PAM(Protospacer Adjacent Motif)的任意革巴 DNA序列进行敲除、插入与定点突变等修饰。同时，CRISPR-Cas9系统还可实现对多个不同 DNA序列的编辑。利用CRISPR位点本身的特点，设计对应不同靶DNA序列的间隔序列插入到 重复序列之间，经过转录加工后形成多个可定位于不同靶序列的双引导RNAUracrRNA: crRNA)，或者串联不同的sgRNA均可对哺乳动物细胞基因组多个不同基因同时进行编辑。 Wang等设计了5个不同基因的gRNA的质粒同时转染到小鼠胚胎干细胞内，结果发现Tetl， Tet2，Tet3和Sry，Uty同时被编辑且效率很高，这对于开发出多位点抗病毒策略至关重要， 同样的结果在斑马鱼，人体细胞，线虫，大鼠，和猴中也得到了验证。此外，CRISPR-Cas9系统 也为基因治疗提供了一个新的、有力的技术手段。例如，李劲松等就利用CRISPR-Cas9系统 成功将小鼠白内障遗传病治愈，Schwank等利用该技术校正人干细胞中一种与囊肿性纤维 化相关联的基因缺陷，Ebina等利用该技术将HIV-1启动子沉默，在转染CRISPR-Cas9质粒的 人干细胞细胞中发现HIV-1的表达明显下降。Kennedy等利用CRISPR-Cas9靶向HPV中的E6、 E7基因，达到了抑制病毒复制以及癌细胞增殖的效果。
[0005] 目前已有研究证实CRISPR-Cas9系统在根治HBV感染等方面具有重大潜力， SuRuLin等分别在Huh-7细胞内和水动力法转染HBV小鼠模型内利用CRSIPR-Cas9系统对带 有HBV基因组(A基因型）的重组质粒进行了破坏，并在一定程度上抑制了 HBV质粒的表达； Christoph Seeger等通过设计针对cccDNA的CRISPR-Cas9系统，证明了CRISPR-Cas9系统具 有对cccDNA序列的破坏以及对HBV感染的抑制作用；S Zhen等在HBV稳定转染模型 HepG2.2.15中利用CRISPR-Cas9降低了乙肝表面抗原和cccDNA的含量。Vyas Ramanan、 Edward M.Kennedy、Xing Liu、Dong C、Lu FM等人也先后利用CRISPR_Cas9革巴向HBV基因组， 并分别在HBV细胞及HBV水动力小鼠模型中实现了对HBV cccDNA以及HBV相关抗原表达的抑 制;Madina Karimova等人利用CRISPR_Cas9革E1向破坏HBV基因组的S区和X区实现了对HBV复 制和表达的抑制，同时在HeLa和HEK293细胞中证实了该系统对整合的HBV基因组的破坏，然 而并未在HBV稳转肝癌细胞模型中以及HBV转基因小鼠模型中对整合状态的HBV DNA进行破 坏或完全清除。然而，已有的研究同时表明，祀向HBV不同区域的gRNA对HBV复制的抑制效果 也存在大不相同。此外，现有研究也均未涉及CRISPR-Cas9系统对整合的HBV DNA的破坏及 清除作用。而且，以上研究均未能阐明CRISPR-Cas9的脱靶效应和细胞毒性对结果的影响。 因此，寻找高效破坏HBV cccDNA及整合状态HBV DNA、抑制HBV复制与表达并且不存在脱靶 效应的CRISPR-Cas9靶点，成为了目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于通过设计、构建、筛选，最终提供一段能同时靶向不同血清型 HBV保守序列的CRISPR-Cas9系统靶点序列，利用该靶点构建的CRISPR-Cas9系统能够高效 地抑制HBV在细胞中的表达和复制，以及对HBV cccDNA和整合状态的HBV DNA具有破坏作 用。
[0007] 为实现上述目的，本发明以CRISPR_Cas9系统的原理及靶序列的选择原则为基础， 通过比对根据保守区域设计了8条gRNA并以PX459-pSpCas9(BB)-2A-Puro(Addgene ID: 48139)为载体构建了相应的CRISPR-Cas9系统。通过筛选和一系列分析测试，最终选出1个 有效的gRNA及其组合。
[0008] 由此，本发明首先提供了一种gRNA序列，所述序列在CRI SPR-Cas9系统中能够以乙 肝病毒基因组S基因保守区域位点为靶序列进行DNA序列的编辑，所述靶序列存在一个原间 区毗邻序列CGG。
[0009] 优选地，所述gRNA序列如SEQ ID N0:2所示。
[0010] 本发明还提供了一种含有上述gRNA序列的CRISPR-Cas9系统，所述gRNA序列与能 表达Cas9蛋白的表达载体相连接。
[0011] 优选地，所述gRNA序列与PX459-pSpCas9 (BB) -2A-Puro质粒相连接。
[0012]在一个优选的技术方案中，所述连接为，先在所述gRNA其5'端加上CACC得到正向 寡核苷酸序列，在其互补链的5'端加上AAAC，之后再与所述质粒连接。
[0013] 本发明又提供了一种上述的CRISPR_Cas9系统序列在在制备治疗乙肝药物中的应 用。
[0014] 最后，本发明提供了 一种含有上述CRI SPR-Cas9系统的组合物，所述组合物还含有 制药学上可接受的载体。
[0015] 优选地，所述组合物被制备为注射剂。
[0016] 本发明最初所构建的8套CRISPR-Cas9系统通过SSA外源活性检测和T7E1内源活性 检测，筛选出了高效的gRNA-S4系统（即S4靶点）。并在HBV稳转细胞模型及HBV水动力小鼠模 型中高效抑制了 HBV的复制和表达，同时并未对细胞的增殖活性产生明显的抑制，也未检测 出明显的脱靶效应。相比S4位点未突变的HBV稳转细胞系，在由gRNA-S4系统引起的S4位点 突变的细胞株上清中的HBsAg的含量降至了阴性临界值以下;上清中的HBV DNA的含量降低 了99.95 ±0.01 % ;细胞内的HBV复制中间体的含量降低了99.87 ±0.25 % ;细胞内HBV cccDNA的含量降低了95.37 ± 0.64%。含有S4靶点的CRISPR-Cas9系统gRNA-S4同时也将HBV 水动力小鼠模型血清中的HBsAg的含量由平均2.35 X 1041U/m 1降至18.931U/m 1;将血清中 的HBV DNA的含量由平均6.25X104IU/ml降至1000IU/ml以下。
[0017]因此，本发明提供了 一个在CRISPR_Cas9特异性抑制HBV复制和表达的过程中高效 的gRNA靶点，同时含有S4靶点的CRISPR-Cas9系统（PX459)能对HBV稳转细胞模型中HBV cccDNA和整合状态的HBV DNA进行破坏。
[0018] 本发明利用所述的CRISPR-Cas9系统能对HBV稳转细胞中整合的HBV DNA和HBV cccDNA进行剪切，并使得细胞上清中的病毒载量下降了99.95 ±0.01 % (n = 3)，细胞中 cccDNA的含量下降了95.37±0.64% (n = 3)。此外，本发明还通过在线预测工具，对该系统 可能存在的3个位点进行了 SURVEYOR分析，发现该系统并未对可能的脱靶位点造成明显影 响。并在水动力法转染HBV小鼠体内，利用该系统将血清中的乙肝表面抗原从注射后7天平 均23504±306511]/1111降至18.93±9.5011]/1111，降低99.91±0.05%，而目前已报道的抑制 HBV的CRISPR-Cas9系统最多仅能将小鼠血清中的HBsAg降低93% (文献:Zhen S，Hua L，Liu YH,Gao LC,Fu J,ffan DY,et al.Harnessing the clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR_associated Cas9system to disrupt the hepatitis B virus.Gene therapy.2015.Epub 2015/02/06. );HBV DNA在注射后第5天从 49905±19417IU/ml 降至 202±200IU/ml(n = 5)，而目前已报道的抑制 HBV 的 CRISPR-Cas9 系 统最多仅能将小鼠血清中的HBV DNA降至105IU/ml(文献:Ramanan V，Shlomai A，Cox DB, Schwartz RE,Michailidis E,Bhatta A,et al.CRISPR/Cas9cleavage