充分溶解后混匀并瞬时离心；
[0168] 根据待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性指控品、HBV定量标准品I~IV的数量 按以下比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备PCR-mix，混匀并瞬时离心备用。
[0169] HBV PCR反应液 30μ1
[0170] HBV 酶混合物 1·5μ1
[0171] 取3μ1核酸释放剂，加入PCR反应管中。分别取待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界 阳性质控品、HBV定量标准品I~IV各3μ1加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打 混匀3-5次，静置5分钟；
[0172]反应条件
[0173]
[0174] 连续9天细胞上清中HBV DNA的检测结果见图6。转染后连续9天，细胞上清中HBV DNA均有明显下降。
[0175] d、检测细胞内HBV复制中间体
[0176] 提取培养第9天细胞中核心颗粒：
[0177] 1.细胞传代至6孔板72h后，每孔加 lml 1 X PBS轻洗，吸弃PBS后加入500μ1含0.5 % ΝΡ-40的PBS，冰上静置30分钟以裂解细胞；
[0178] 2.细胞裂解液转移到新的ΕΡ管中，lOOOOrpm离心5分钟，将细胞碎片沉淀；
[0179] 3.转移450μ1上清至新的EP管中，加入5μ1 1M MgCl2,使终浓度达到10m mol/L，然 后加入ΙμL DNase I(10U)和0·5μ1 RNaseA(20U)，37°C水浴至少lh，去除游离的HBV DNA和 RNA模板；
[0180] 4.配制蛋白酶K混合溶液，总体积按600μ1计算:60μ1 0.5M EDTA(终浓度50mmol/ υ+60μ1 1M Tris(PH8.0)(终浓度50mmol/L)+30yl 10%SDS(终浓度0·5%)+15μ1 20mg/mL Proteinase K(终浓度50mmol/L)+10yl5M NaCl(终浓度为 100mmol/L)，分至各样品管；
[0181] 5.涡旋混匀，短暂离心后42 °C消化过夜，
[0182] 6.加等体积的酚氯仿溶液抽提，上下颠倒数次，lOOOOrpm离心15分钟；
[0183] 7.转移上层均匀相到新EP管中，加1/10体积的3M NaAc，等体积的异丙醇，混合后4 °C下12000rpm离心45分钟；
[0184] 8·500μ1 75% 的乙醇洗一次，4°C 下 12000rpm 离心 15 分钟；
[0185] 9.自然干燥，加入30μ1 TE溶解核酸，_80°C冻存备用。
[0186] 实时荧光PCR检测方法同细胞上清中HBV DNA定量检测（鑫诺美迪HBV DNA荧光定 量检测试剂盒），检测结果见图7,结果显示，转染后第9天，细胞中HBV复制中间体显著下降。
[0187] 2、检测gRNA_S4转染HBV稳转细胞后的细胞增殖活性
[0188] 1.收集细胞，加细胞悬液100μ1 (约5,000_10,000个细胞)到96孔板(边缘孔用无菌 水或PBS填充）。设置空白孔(有培养基，无细胞)和对照孔(培养基不加药，有细胞），每组设 定3_5复孔。
[0189] 2 ·置37°C，5%C02孵育过夜，倒置显微镜下观察。
[0190] 3.每孔加入?ομL待检测药物溶液，37 °C孵育。
[0191] 4.每孔加入10μ1 CCK-8溶液，37°C孵育1-4小时。
[0192] 5.测定450nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用450-490nm的滤光片。
[0193] 6.结果分析:将各测试孔的0D值减去调零孔0D值或对照孔0D值。各重复孔的0D值 取平均数。细胞活力％ =(加药细胞0D-空白0D) /(对照细胞0D-空白0D) X 100 %
[0194] 转染后连续3天的检测结果见图8,结果显示，gRNA_S4位点并未对细胞的增殖活性 造成影响。
[0195] 3、检测gRNA_S4系统稳转细胞后的脱靶效应
[0196] 利用脱革E位点在线预测工具(http: //crispr. mi t. edu/)预测gRNA-S4系统最可能 存在的20个脱靶位点，
[0197] 表3. gRNA_S4系统可能存在的脱靶位点
[0198]
[0199] 选取评分高的脱靶位点进行扩增后T7E1酶切验证
[0200] 表4.PCR扩增引物如下：
[0201]
[0202]
[0204]
[0203] 1汗〇財广增（丁&1?5瓜）：
[0205]
[0206] 2)PCR产物退火，使用PCR仪进行退火处理，设置程序如下： 95 °C 5分钟 94°C 2秒，-0.丨°(：/循环，200个循坏
[0207] 75°C 1秒，-O.rc/循环,600个循坏 16°C 2分钟
[0208] 3)T7E1 酶切反应：
[0209] 上述反应体系分别加入0·5μ1 T7E1酶(NEB)，37°C反应30分钟后，立刻加2μ1 DNA6 X Loading Buf f er，混勾后65°C反应10分钟，利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结 果。并利用退火后未酶切的产物作为阳性对照，结果显示gRNA-S4并未对三个最可能的脱靶 位点造成可检测到的突变(参见图4B)。
[0210] 4、深度测序检测gRNA-S4系统转染细胞后S4位点的突变情况
[0211] 1)PCR 扩增 S4 位点（Takara):
[0212] 引物见实施例1中S4-F、S4_R
[0213]
[0214]
[0224]
[0225] 3)将上述两种体系混合，室温孵育30分钟。
[0226] 4)将反应体系加入直径10cm的细胞培养皿，培养48h后加 puro筛选以提高转染效 率
[0227] 5)将筛选后的两组细胞按每孔1个细胞分至10个96孔板，每组5个孔板，传代培养 至48孔板，提取每个孔中的细胞总DNA。
[0228] 6)用实施例一中的引物S4-F，S4-R进行扩增
[0229]
[0230] 12345 7)对PCR产物进行纯化后测序(华大基因），筛选出S4位点突变的6株细胞，结果见 图9。 2 2、检测S4位点突变后细胞上清中HBV表面抗原、HBV DNA，细胞内HBV复制中间体、 HBV表面抗原、和c c cDNA 3 将筛选出的两组细胞(对照株N1和突变株T11)按每孔2 X104个细胞分至3个24孔 板，每组30个孔，每组每天收取3个孔的细胞及上清，连续收9天，期间不换液。 4 a、检测细胞上清中HBV表面抗原 5 使用罗氏诊断EleCSyS?HBsAg II定量检测方法检测连续9天细胞上清中的乙肝 表面抗原(见图10)。结果显示，在S4位点突变的细胞株上清中连续9天乙肝表面抗原的含量 已低至阴性临界值以下(〇.〇5IU/ml)。
[0236] b、检测细胞上清中HBV DNA(鑫诺美迪HBV DNA荧光定量检测试剂盒）
[0237] 取出试剂盒中组分，室温放置，待其充分溶解后混匀并瞬时离心；
[0238] 根据待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界阳性指控品、HBV定量标准品I~IV的数量 按以下比例取相应量的试剂加入灭菌的离心管中，制备PCR-mix，混匀并瞬时离心备用。
[0239] HBV PCR反应液 30
[0240] HBV酶混合物 1.5
[0241] 取3μ 1核酸释放剂，加入PCR反应管中。分别取待测样本、HBV阳性质控品、HBV临界 阳性质控品、HBV定量标准品I~IV各3μ1加入对应的PCR反应管中，并用移液器在管底吹打 混匀3-5次，静置5分钟；
[0242]反应条件
[0243]
[0244]
[0245] 连续9天细胞上清中HBV DNA的检测结果见图11。结果显示，S4位点突变的细胞株 上清中连续9天HBV DNA的含量已低至阴性临界值(1000IU/ml)。
[0246] c、检测细胞内HBV复制中间体
[0247] 提取培养第9天细胞中核心颗粒：
[0248] 1.细胞传代至6孔板72h后，每孔加1ml 1 X PBS轻洗，吸弃PBS后加入500μ1含0.5 % ΝΡ-40的PBS，冰上静置30分钟以裂解细胞；
[0249] 2.细胞裂解液转移到新的ΕΡ管中，lOOOOrpm离心5分钟，将细胞碎片沉淀；
[0250] 3.转移450μ1上清至新的EP管中，加入5μ1 1M MgC12,使终浓度达到10m mol/L，然 后加入ΙμL DNase I(10U)和0·5μ1 RNaseA(20U)，37°C水浴至少lh，去除游离的HBV DNA和 RNA模板；
[0251] 4.配制蛋白酶K混合溶液，总体积按600μ1计算:60μ1 0.5M EDTA(终浓度50mmol/ L)+60yl 1M Tris(PH8.0)(终浓度50mmol/L)+30yll0%SDS(终浓度0·5%)+15μ1 20mg/mL Proteinase K(终浓度50mmol/L)+10yl 5M NaCl(终浓度为 100mmol/L)，分至各样品管；
[0252] 5.涡旋混匀，短暂离心后42°C消化过夜，
[0253] 6.加等体积的酚氯仿溶液抽提，上下颠倒数次，lOOOOrpm离心15分钟；
[0254] 7.转移上层均匀相到新EP管中，加1/10体积的3M NaAc，等体积的异丙醇，混合后4 °C下12000rpm离心45分钟；
[0255] 8·500μ1 75% 的乙醇洗一次，4Γ 下 12000rpm 离心 15 分钟；
[0256] 9.自然干燥，加入30μ1 TE溶解核酸，_80°C冻存备用。
[0257] 实时荧光PCR检测方法同细胞上清中HBV DNA定量检测（鑫诺美迪HBV DNA荧光定 量检测试剂盒），检测结果见图12,结果显示，S4位点突变的细胞株中连续9天培养后HBV复 制中间体的含量相比对照组降低了99.87 ±0.25%。
[0258] d、检测HBV cccDNA
[0259] 细胞总DNA的提取(Biomed DN0712)
[0260] 1)收集约105-106悬浮细胞到一个1.5ml离心管;对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白 酶消化后吹打下来收集。
[0261] 2)13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约10-20μ1残留 的液体。
[0262] 3)加200μ1 1 X roS重悬洗涤细胞，13，OOOrpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸 弃上清，将细胞沉淀重悬于180μ1 1XPBS中。
[0263] 4)加入20μ1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀（可选步骤：为清除RNA，加入5μ1 RNase A( 10mg/ml)，振荡混匀，可选择室温放置5分钟），再加入200μ1结合液CB，立刻涡旋振 荡充分混匀，在70 °C放置10分钟。
[0264] 5)冷却后加100μ1异丙醇（或200μ1无水乙醇），立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能 会出现絮状沉淀。
[0265] 6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集 管中）13，OOOrpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
[0266] 7)加入500μ1抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。
[0267] 8)加入500μ1漂洗液WB(先检查是否已加入无水乙醇！），12,000rpm离心30秒，弃掉 废液。
[0268] 9)加入500μ1漂洗液WB，12, OOOrpm离心30秒，弃掉废液。
[0269] 10)将吸附柱AC放回空收集管中，13，OOOrpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂 洗液中残留乙醇抑制下游反应。
[0270] 11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μ 1洗脱 缓冲液ΕΒ(洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中预热效果更好），室温放置3-5分钟，12，000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12，OOOrpm离心1分钟。
[0271] 12)DNA可以存放在2-8°C，如果要长时间存放，可以放置在一20°CPSAD酶消化。
[0272] 反应体系： DNA 8.5 μΙ
[0273] , PSAD 酶 0.4 μL PSAD Buffer 2