；
[0072] 95Γ5 分钟；
[0073] 缓慢降至室温
[0074]将退火后的产物稀释200倍。
[0075] 退火后将形成的双链DNA连接至PX459-pSpCas9(BB)-2A-Puro(Addgene ID: 48139)表达载体上，以下简称PX459。得到带有针对HBV DNA靶点的CRISPR-Cas9系统。
[0076] 连接体系：
[0077]
[0078]
[0079] 消化未连接的线性DNA
[0080]消化体系： 上一步连接产物 11μ1 10 X Plasmid safe Buffer 1.5μ1 _] ATP (lOmM) 1.5μΙ Plasmid Safe exonuclease ΙμL 总体积 15μ1
[0082] 反应条件：37 Γ 30分钟
[0083] 70 °C 30 分钟
[0084] 将上述步骤得到的连接产物转化stbl3感受态细胞，涂布于Amp+的LB平板，挑取阳 性克隆接菌，37°C摇菌过夜，质粒小体试剂盒提取质粒并进行测序鉴定，得到PX459-U6-HBV gRNA重组质粒。
[0085] 3、细胞培养和转染
[0086] a、细胞的传代培养
[0087] 1)肥皂洗手，在进行无菌操作前，用75 %的酒精擦拭双手。同时，用酒精棉球擦拭 超净台。
[0088] 2)将培养液放置室温，备用。
[0089] 3)打开超净台内的紫外灯，照射30分钟；同时，将实验所需材料也放入超净台进行 灭菌。
[0090] 4)倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。
[0091 ] 5)关闭超净台的紫外灯，打开风机。
[0092] 6)点燃酒精灯，取出刻度吸管，在火焰上略烧，然后，安上吸球待用。
[0093] 7)在打开培养瓶之前，用酒精棉球擦拭瓶盖，打开后，瓶口在酒精灯上过火焰，再 用吸管轻轻吸出旧的培养液，吸管不要碰到布满细胞的培养瓶的侧壁。
[0094] 8)将胰酶加入培养瓶内，显微镜下随时观察，见到细胞的突起消失，变圆时，立即 翻转培养瓶，吸出胰酶;不要消化时间过长，否则，细胞会被胰酶消化掉。
[0095] 9)加入适量Hanks液或培养基清洗一遍，立即倒掉。
[0096] 10)加入含有10 %血清的培养基，用吹打管轻轻吹打，使其从瓶壁上脱落分散到培 养基中，再补加培养基，按1:3进行分瓶。然后，用火焰烧培养瓶的瓶口和盖，再盖好培养瓶 的盖，放到培养箱中进行培养。
[0097] b、细胞转染（Lipofectamine LTX(Thermo Fisher))
[0098] 1)待细胞贴壁生长到约铺满90%的直径10cm细胞培养皿时进行转染。
[0099] 2)转染体系(每孔）：
[0100] Opti-MEM ?Medium 500μ1+Lipofectamine ?LTX Reagent22.5yl
[0101]
[0102] 3)将上述两种体系混合，室温孵育30分钟。
[0103] 4)将反应体系加入直径10cm的细胞培养皿，培养48h后加 puro筛选以提高转染效 率。
[0104] 4、luciferase SSA重组修复检测Cas9/gRNA活性
[0105]使用北京唯上立德的SSA活性报道质粒构建试剂盒进行检测(Catalog.No. VK002) ，Luc if erase SSA重组修复检测Cas9/gRNA活性的原理:一个终止子在luciferase的编码区 中央，truncated luciferase没有活性。为检测Cas9/gRNA剪切活性，将一个Cas9/gRNA的革巴 点位置序列插在终止子后，构建SSA活性报道质粒。在Cas9/gRNA的作用下，靶点位置被剪切 产生DSB(双链断裂，double-strand break)，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有 活性的luciferase。通过与参照的比值变化反应Cas9/gRNA剪切DNA的活性水平。
[0106] 构建报告质粒的步骤：
[0107] 设计引物：
[0108] 例如某gRNA的靶点位置:aGGACTTGTGCTGCTAAGTTAJC^c(斜体:PAM序列），则合成 序列为：
[0109] Target-Sense:5 '-GATCAGGACTTGTGCTGCTAAGTTA/4
[0110] Target-Anti:5'-TCGAGCCTTAACTTAGCAGCACAAGTCCT
[0111] b、报告质粒的构建
[0112] 步骤一:将合成的引物各稀释成100μΜ
[0113] 体系： Target-Sense ΙμL Target-Anti ΙμΙ Solution KVK002-2) 2.5μ1
[0114] Solution 2(VK002-3) 2.5μ1 Solution 3(VK002-4) ΙμΙ H20 17μ1 最终体系 25μ1 反应程序：ym ih 95 υ 5分钟
[0115] 951：到25。〇 -1〇C/20S 16 Φ0 5分钟
[0116] 步骤二：
[0117] 体系：
[0118] pSSA-luc Vector(VK002-l) ΙμΙ 步骤一最终产物稀释10倍 1 μL Solution A(VK002-5) ΙμΙ
[0119] SolutionB(VK002-6) ΙμΙ Η20 6μ1 最终体系 10μ1
[0120] 反应条件：16 °C反应2小时后，插至冰上
[0121] C、转化
[0122] (1)取上述步骤二的反应产物加入到50μ1感受态细胞(如DH5a)中（在感受态细胞 刚刚解冻时加入连接产物），轻弹混匀，冰浴30分钟。
[0123] (2)42°C热激30秒，立即置于冰上2分钟。加500μ1无抗S0C或LB溶液，于170转37°C 孵育1小时。
[0124] (3)取100μ1均匀地涂于卡那霉素抗性平板上，37°C培养过夜。
[0125] d、阳性克隆的鉴定一菌落PCR方法鉴定阳性克隆
[0126] 挑选克隆至10μ1灭菌水中，涡旋混合。取ΙμL为模板进行PCR，反应条件为94Γ10分 钟，94 °C 30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸(根据片段的大小确定延伸时间），30个循环，72 °C 10 分钟。菌落PCR使用引物及测序引物使用Sq_FP(VK002-7)和Sq_RP(VK002-8)引物。若载体自 连，自连带大小约为160bp。
[0127] e、SSA活性的检测
[0128] 将构建好的CRISPR_Cas9质粒与上述构建好的reporter质粒pSSA-luc-target和 Reni 1 la luciferase质粒按CRISPR_Cas9质粒200ng: pSSA-luc-target质粒30ng: Reni 1 la luciferase质粒5ng的比例共转染到48孔板的人类293T细胞中，24小时后检查luciferase 酶活性。每个实验重复3组，其中control组用阴性参照质粒补齐。通过luciferase提高的倍 数反应出Cas9/gRNA的活性。同时转染阳性Cas9/gRNA和相应的报导质粒作为阳性参照。图3 结果显示不同gRNA所具有的剪切效率各不相同，其中gRNA-S4的外源剪切效率最高。
[0129] 5、提取HBV DNA以及测序和酶切检测CRISPR-Cas9引起的突变效率
[0130] a、提取 HepG2.A64 细胞系基因组(Biomed)
[0131] 1)收集约105-106悬浮细胞到一个1.5ml离心管;对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶 消化后吹打下来收集。
[0132] 2)13,000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约10-20μ1残留 的液体。
[0133] 3)加200μ1 1 X roS重悬洗涤细胞，13，OOOrpm离心10秒，使细胞沉淀下来。完全吸 弃上清，将细胞沉淀重悬于180μ1 1XPBS中。
[0134] 4)加入20μ1蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀（可选步骤：为清除RNA，加入5μ1 RNase A( 10mg/ml)，振荡混匀，可选择室温放置5分钟），再加入200μ1结合液CB，立刻涡旋振 荡充分混匀，在70 °C放置10分钟。
[0135] 5)冷却后加100μ1异丙醇（或200μ1无水乙醇），立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能 会出现絮状沉淀。
[0136] 6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集 管中）13，OOOrpm离心60秒，倒掉收集管中的废液。
[0137] 7)加入500μ1抑制物去除液IR，12,000rpm离心30秒，弃废液。
[0138] 8)加入500μ1漂洗液WB(先检查是否已加入无水乙醇！），12,000rpm离心30秒，弃掉 废液。
[0139] 9)加入500μ1漂洗液WB，12, OOOrpm离心30秒，弃掉废液。
[0140] 10)将吸附柱AC放回空收集管中，13，OOOrpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂 洗液中残留乙醇抑制下游反应。
[0141] 11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μ1洗脱 缓冲液ΕΒ(洗脱缓冲液事先在65-70°C水浴中预热效果更好），室温放置3-5分钟，12，000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12，OOOrpm离心1分钟。
[0142] 12)DNA可以存放在2-8°C，如果要长时间存放，可以放置在一20°C。
[0143] b、测序和T7E1酶切检测突变情况
[0144] 表2.PCR扩增所需引物：
[0145]
[0146]
[0147] 1汗〇財广增（丁&1?1瓜）：
[0148]
[0149]
[0150] 2)PCR产物退火，使用PCR仪进行退火处理，设置程序如下： 95V 5分钟 941： 2秒，-O.rC/循环，200个循环
[0151] t 751： :1秒，-O.rC/循环，600个循环 161 2分钟
[0152] 3)T7E1 酶切反应：
[0153] 上述反应体系分别加入0.5μ1 T7E1酶(NEB)，37°C反应30分钟后，立刻加2μ1 DNA6 X Loading Buf f er，混勾后65°C反应10分钟，利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结 果。并利用退火后未酶切的产物作为阳性对照(参见图4A，4B)。A图显示除gRNA-S4外，其余4 条gRNA内源剪切活性较低;B图显示gRNA-S4有效地对HBV基因组上S4靶点进行了剪切（图中 箭头所指），并且gRNA-S4系统对其最可能的三个脱靶位点并无明显的剪切作用。
[0154] 实施例2:gRNA-S4靶点抑制HBV复制效果的评价
[0155] 1、检测gRNA-S4转染HBV稳转细胞后HBV表面抗原、HBV DNA和HBV复制中间体
[0156] a、细胞转染带有S4靶点的CRISPR_Cas9系统及不带靶点的CRISPR_Cas9系统（对 照）
[0157] 1)待细胞贴壁生长到约铺满90%的直径10cm细胞培养皿时进行转染。
[0158] 2)转染体系(每孔）：
[0159] .Opti-M.EM. ? Medium 5〇Ομ1+ Lipofectamine ?LTX Reagent22 · δμL 「01601
[0161 ] 3)将上述两种体系混合，室温孵育30分钟。
[0162] 4)将反应体系加入直径10cm的细胞培养皿，培养48h后加 puro筛选以提高转染效 率
[0163] 5)将筛选后的两组细胞按每孔2 X 104个细胞分至3个24孔板，每组30个孔，每组每 天收取3个孔的细胞及上清，连续收9天，期间不换液。
[0164] b、检测细胞上清中HBV表面抗原
[0165] 使用罗氏诊断Elecsys⑧HBsAg II定量检测方法检测连续9天细胞上清中的乙肝 表面抗原（图5)。结果显示，在转染后连续9天中，细胞上清中乙肝表面抗原均有明显下降。
[0166] c、检测细胞上清中HBV DNA(鑫诺美迪HBV DNA荧光定量检测试剂盒）
[0167] 取出试剂盒中组分，室温放置，待其