>[0090] Na2HP04-Na0H缓冲液：配置50mM磷酸氢二钠溶液，用氢氧化钠分别调节至pH 10. 5 ~12. 0〇
[0091] 最适反应温度和温度稳定性,参见图4。
[0092] 几丁质酶最适温度测定：将几丁质酶用最适pH值缓冲液稀释合适倍数后，于不同 温度40~70°C下测定几丁质酶酶活力。以最大酶活力为100%，分别计算各温度下的相对 酶活力。温度稳定性测定：将酶液用50mM的最适pH缓冲液稀释合适倍数后，置于不同温度 的水浴锅中保温30min，立即冰水浴冷却30min，以标准方法测定残余酶活力，以未经处理 的酶液酶活力作为对照。
[0093] 几丁质酶PbChi70在ρΗ5· 5柠檬酸缓冲液中活性最高，以最高酶活力作为100%， 计算其它缓冲液及pH值下的相对酶活力，结果见图3(A)。以未经处理的酶液酶活力作为 100%，计算丁质酶PbChi70在各不同缓冲液及pH值下处理30min后的相对酶活力，结果见 图3 (B)。结果表明PbChi70在较宽的pH4. 0~9. 5范围内稳定，残余酶活力能保持在80% 以上。
[0094] 几丁质酶PbChi70在55°C反应温度下活性最高，以该酶活力作为100%，计算其它 温度下的相对酶活力，结果见图4(A)。将未经处理的酶液酶活力作为100%，计算几丁质酶 PbChi70在不同温度下处理30min后的相对酶活，结果见图4(B)。结果表明PbChi70具有 良好的温度稳定性，在55°C下保温30min仍残余79%酶活力。
[0095] 实施例4内切几丁质酶的水解特性
[0096] 用50mM pH 5. 5的磷酸盐缓冲液配置1 % (w/v)的胶体几丁质和再生几 丁质作为水解底物，加入几丁质酶PbChi70 (lU/mL)，50°C水浴水解4h，定时取样，采 用薄层层析（TLC，Kieselgel 60)法定性检测水解产物。TLC分析时，展层液为：正 丁醇：水：乙酸=2:1:1;显色方法参考 Kopparapu 等（Kopparapu et al. A novel thermostable chitinase (PJC)from pomegranate(Punica granatum)juice. Food Chemistry, 127:1569-1575)的方法。显色溶液I的配置：5mL 50%浓度的氢氧化钾与20mL 无水乙醇混匀，取此溶液0. 5mL与0. 5mL乙酰丙酮和正丁醇的混合溶液即：乙酰丙酮0. 5mL 和正丁醇10mL混合而成的混合溶液，氢氧化钾和乙醇的混合溶液以及乙酰丙酮和正丁醇 的混合溶液都需现配现用。溶液II的配置：lg对甲氨基苯甲醛溶于30mL无水乙醇中，再加 30mL浓盐酸。显色时，先将溶液I均匀喷洒在TLC平板表面，105°C加热5min，然后再将溶 液II均匀喷洒在TLC平板表面，最后90°C烘烤5min显色。
[0097] 图5结果表明，该酶水解胶体几丁质和再生几丁质的终产物（4h)以单糖和几丁二 糖为主。而在初始阶段0~30min，主要产生几丁二糖、几丁三糖和少量的几丁四糖，随后三 糖或四糖被继续降解为单糖及二糖。
[0098] 图6为几丁质酶水解不同聚合度几丁寡糖的产物分析图。结果表明几丁质酶 PbChi70能够水解几丁三糖、四糖和五糖，但不能水解几丁二糖。水解特性表明本发明的几 丁质酶属于内切型几丁质酶。
[0099] 实施例5几丁质酶在制备几丁二糖中的应用
[0100] 在500mL反应体系即50mM pH 5. 5柠檬酸缓冲液中，加入预先制备的终浓度3%胶 体几丁质，及纯化后的终浓度5U/mL几丁质酶PbChi70, 50°C下150rpm震荡水解24h。沸水 浴lOmin将酶灭活，冷却后过滤收集滤液。采用实施例4中的TLC法及HPLC法分析测定水 解液中产物的组成及几丁二糖的纯度。
[0101] HPLC 测定条件为：HPLC-ELSD 检测系统（Agilent 1260Series，Agilent Technologies，USA)，Sugar-D 层析柱 4· 61 X 250mm(cosmosil, Japan)，乙臆 / 水（75:25, v/ v)作为流动相，流速为lmL/min。
[0102] 进一步采用活性炭柱分离制备几丁二糖，其中φ=2.6 cm，H = 50cm，用50%乙醇 溶液及去离子水分别平衡层析柱4h备用，其中流速为lmL/min。将糖液真空浓缩后上样，并 用总体积1. 8L的0~40%乙醇溶液线性洗脱。洗脱液采用自动部分收集器收集，10mL/管。 DNS法测定收集样品的还原糖含量，分别采用TLC法和HPLC法定性和定量分析收集的组分， 合并同一组分的收集液，50°C下真空旋转蒸发浓缩，然后在糖液中加入适量乙醇结晶。
[0103] 图7结果表明，水解液中的主要组分为几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖，其中几丁 二糖的含量达到80. 4%，水解率达到89. 5%。采用活性炭色谱层析分离水解液制备几丁 二糖，结果表明能够将水解液中所产的几丁二糖与N-乙酰氨基葡萄糖完全分开，回收率为 87 %。几丁二糖糖液经过结晶后得到晶体，产率为61 %，几丁二糖的纯度达到99 %。
[0104] 所述水解率为PbChi70产生的还原糖质量除以初始底物质量的百分比。
[0105] 所述回收率为几丁二糖经纯化后的质量除以PbChi70水解产生二糖质量的百分 比。
[0106] 所述产率为几丁二糖晶体质量除以初始底物质量的百分比。
[0107] 以上所述仅为本发明的较佳可行实施例，并非因此局限本发明的专利范围，故凡 是运用本发明说明书及附图内容所作的等效变化，均包含于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种内切几丁质酶，是如下1)~3)中的一种蛋白质： 1) 由序列表中序列2的第40~696所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 3) 将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有几丁质酶活性的由1)衍生的蛋白质。2. 权利要求1所述内切几丁质酶的编码基因。3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于：编码基因为如下1)~4)中任一基因： 1) 其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第118~2091位； 2) 其编码序列是序列表中序列1 ; 3) 在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码如权利要求1所述蛋白质的基因； 4) 与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码如权利要求1所述蛋白质的基因。4. 扩增如权利要求2或3所述基因全长或其任一片段的引物对。5. 含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。6. 如权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体是在pET28a⑴的 BamH I和Xho I酶切位点间插入所述基因得到的重组表达载体。7. 如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，将所述的重组载体导入大肠杆菌得到的 重组大肠杆菌。8. -种表达内切几丁质酶的方法，是发酵培养如权利要求5或7所述重组菌，得到内切 几丁质酶。9. 如权利要求8所述的方法，发酵培养条件是：培养温度是37°C至0D_达到0. 6~ 0. 8,加入终浓度ImM异丙基硫代-β -D-半乳糖苷（IPTG)，30°C培养过夜。10. 权利要求1所述内切几丁质酶在水解几丁质中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种内切几丁质酶及其编码基因和在生产几丁二糖中的应用。蛋白是如下(a)或(b)或(c)：(a)由序列2自N末端40至696位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)有序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶活性的由序列1衍生的蛋白质。利用本发明提供的几丁质酶制备几丁二糖，转化率高，能源消耗少，无污染物产生，具有重要的经济价值。本发明蛋白在工业应用中具有较大潜力。CGMCC 953020140820
【IPC分类】C12R1/01, C12N9/42, C12N15/70, C12N15/56, C12P19/14, C12N1/21, C12P19/26
【公开号】CN105647888
【申请号】
【发明人】闫巧娟, 付星, 杨绍青, 江正强, 郭禹, 杨鑫斌
【申请人】中国农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2014年11月14日