此序列，设计几丁质酶基 因上下游引物Chi2F和Chi2R，扩增到一段2, 091bp片段，如序列表1所示。测序结果显示 扩增到几丁质酶PbChi70基因全长。几丁质酶PbChi70的核苷酸序列编码了 696个氨基酸 和一个终止密码子。SignalP 4.0预测到该蛋白N端含有一段39个氨基酸残基的信号肽。 预测成熟蛋白分子量和等电点分别是70kDa和5. 65。NCBI中BLAST比对分析显示，在已 报道的有关性质研究的几丁质酶中，与来源于Bacillus circulans(P20533. 1)的18家族 几丁质酶相似性最高为 72% ;与来源于 Paenibacillus sp.FPU-7(BAM67142. l)、Bacillus pumilus(ABIl5〇82· 1)和 Bacillus sp.DAU101(ABC66〇95· 1)的 I8 家族几丁质酶相似性分 别为67%、61 %和61 %。结构域分析显示，几丁质酶PbChi2含有一个18家族特征结构域、 一个3型纤连蛋白结构域和一个几丁质结合相关的ChiAl-BD结构域。
[0062] 实施例2内切几丁质酶基因的表达
[0063] 一、构建重组表达载体
[0064] 以巴伦葛兹类芽孢杆菌基因组DNA为模板，利用基因上下游引物Chi2EF和Chi2ER 扩增去除信号肽的几丁质酶PbChi70基因，PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图2。回 收PCR扩增产物，连接pMD18-T载体，热激法转化大肠杆菌DH5 α，将阳性重组质粒命名为 pMD18-T-PbChi70,送往测序。双酶切质粒pMD18-T-PbChi70,回收目的基因片段，与经同样 双酶切的表达载体pET_28a(+)相连，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，提取质粒酶切鉴定阳 性重组子，将构建正确的重组质粒命名为pET28a-PbChi70。
[0065] 二、构建重组菌
[0066] 将上步骤获得的重组质粒PET28a-PbChi70通过热激法转化大肠杆菌BL21 (DE3)， 得到含有重组质粒pET28a-PbChi70的重组菌，将其命名为重组菌BL-pET28a-PbChi70。将 pET-28a(+)载体通过热激法转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得到含有pET-28a(+)载体的重组 菌，将其命名为对照组。
[0067] 实施例3内切几丁质酶的纯化及性质测定
[0068] 一、几丁质酶的纯化
[0069] 挑取阳性克隆子于50mL LB液体培养基中（50 μ g/mL)，37°C摇床培养至对数期， 用作种子液。接种种子液于l〇〇mL LB液体培养基中，可用500mL三角瓶，含卡那霉素50 μ g/ mL，37°C摇床培养至0D600达到0. 6~0. 8时添加终浓度为ImM的IPTG，30°C摇床培养诱导 过夜。
[0070] 培养结束后10, 000rpm、2min离心收集菌液，菌液用20mLpH 7. 4磷酸盐缓冲液悬 浮，200W、超3s、间歇4s、超90次超声破碎细胞。细胞破碎后，10, OOOrpm，lOmin离心收集上 清即粗酶液。用磷酸盐缓冲液重悬沉淀，保存，用作电泳分析蛋白表达情况。引物设计时保 留pET-28a(+)质粒N端的组氨酸标签，利用Ni-IDA(镍离子螯合亲和层析）柱纯化蛋白。 纯化方法：用20mL磷酸盐缓冲液、pH 7. 4平衡缓冲液平衡Ni-IDA柱5-10个柱体积；将粗 酶液以〇. 5mL/min流速上样；用缓冲液A即：50mM磷酸盐缓冲液、0. 5M NaCl、20mM咪唑、pH 7. 4,流速lmL/min洗涤柱子，至流穿液0D280小于0. 05 ;用缓冲液B即：50mM磷酸盐缓冲 液，0. 5M NaCl，80mM咪唑；pH 7. 4,洗涤柱子至流穿液0D280小于0. 05 ;用缓冲液C(50mM 磷酸盐缓冲液，〇. 5M NaCl，120mM咪唑；pH 7.4)洗脱蛋白并用离心管收集，SDS-PAGE检测 蛋白纯度(Laemmli et al. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970,227:680_685)〇
[0071] 二、几丁质酶的分子量及活力测定
[0072] 蛋白分子量测定：（1)采用SDS-PAGE法测定，分离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓 度为4. 5%。低分子量标准蛋白为：磷酸化酶b(97. 2kDa)，白蛋白（66.4kDa)，卵清蛋白 (44. 3kDa)，碳酸酐酶（29kDa)，胰蛋白酶制剂（20. lkDa)和溶菌酶（14. 3kDa)。
[0073] 几丁质酶酶活力的测定：取200 μ L处理好的胶体几丁质（1 %，w/v)于1. 5mL离心 管中，50°C水浴锅预热lOmin后加入200 μ L适当稀释的酶液反应30min。反应释放出的还原 糖量参照 Miller 等的方法测定（Miller et al. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 1959, 31:426-428.), 即在反应液中加入600iiL DNS试剂终止反应，然后沸水中显色lOmin。显色完成后， 10,000rpm离心10min，检测540nm处吸光值。几丁质酶酶活力单位（1U)定义为在上述反 应条件下每分钟反应生成1 U mol还原糖所需要的酶量。
[0074] 蛋白含量测定：参照 Lowry 等的方法（Lowry et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 1951，193:265-275)以牛 血清蛋白作为标准蛋白。
[0075] 实验设3次重复，结果取平均值。
[0076] PbChi70的纯化情况见表3。分别将粗酶液和纯酶液作为待测酶液，并以对应灭活 的蛋白作为对照组，检测几丁质酶活性。粗酶液的总酶活力为642. 7U，其比活力为12. 9U/ mg。纯酶液的总酶活力为333. 8U，其比活力为30. lU/mg。
[0077] 表3几丁质酶的纯化表
[0078]
[0079] 几丁质酶酶活力在55°C，pH 5. 5的柠檬酸缓冲液中按标准方法测定。
[0080] 如图2所示，重组几丁质酶经过Ni-IDA -步纯化后得到纯酶，酶活力回收率见表 3 为 51. 9%〇
[0081] 三、几丁质酶的酶学性质
[0082] 最适pH和pH稳定性，参见图3。
[0083] 最适pH :将几丁质酶加入不同pH值的6种不同缓冲液体系中，包括柠檬酸盐缓冲 液pH 3. 0~6. 0,乙酸钠缓冲液pH 4 0~5. 5, MES缓冲液pH 5. 5~6. 5,磷酸盐缓冲液 pH 6. 0 ~8. 0, Tris 盐酸缓冲液 pH 7. 0 ~9. 0, Glycine-NaOH 缓冲液 pH 9. 0 ~10. 5 和 Na2HP04-Na0H缓冲液pH 10. 5~12. 0。在55°C条件下测定酶活力，以酶活力最高点为100% 作图。pH稳定性：分别用上述不同pH值的反应体系稀释纯酶液，将稀释后的酶液置于40°C 水浴锅中保温30min，迅速将样品置于冰水浴中冷却30min，按照标准方法测定酶活力，以 未经处理的酶液作为对照，分别计算各pH处理后的残余活力。
[0084] 柠檬酸盐缓冲液：分别配置50mM柠檬酸和柠檬酸钠溶液，将两者按照不同比例混 合分别调节至pH 3.0~6.0。
[0085] 乙酸钠缓冲液：配置50mM乙酸钠溶液，用乙酸分别调节至pH 4. 0~5. 5。
[0086] MES缓冲液：配置50mM MES溶液，用氢氧化钠分别调节至pH 5. 5~6. 5。
[0087] 磷酸盐缓冲液：分别配置50mM磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，将两者按照不同比 例混合分别调节至pH 6. 0~8. 0。
[0088] Tris盐酸缓冲液：配置50mM Tris溶液，用盐酸分别调节至pH 7. 0~9. 0。
[0089] Glycine-NaOH缓冲液：配置50mMGlycine溶液，用氢氧化钠分别调节至pH 9. 0~ 10. 5〇