学诱变、基因工程等手段将序列表中序 列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，仍具有 几丁质酶活性的蛋白质。
[0014] 为了使1)中的PbChi70便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1标签的序列
[0016]
[0017] 上述2)中的PbChi70可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到〇 上述2)中的PbChi70的编码基因可通过将序列表中序列1自5'末端第1-2091位碱基所 示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错 义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0018] 上述2)的蛋白质具体可以是在所述1)的蛋白质的C-端带上6个His标签的蛋 白质。
[0019] 所述内切几丁质酶PbChi70蛋白质的编码基因，也属于本发明的保护范围。
[0020] 所述内切几丁质酶PbChi70的编码基因，具体为如下1)~4)中任一所述的基因：
[0021] 1)其编码序列是序列表中序列1的自5'末端第1~2091位；
[0022] 2)其核苷酸序列是序列表中的序列1的自5'末端第1~1014位；
[0023] 3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码如所述蛋白质的基因；
[0024] 4)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码如所述蛋白质的基因。
[0025] 序列表中的序列1由2091个碱基组成，其开放阅读框架（0RF)为自5'末端第 1-2091位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的PbChi70蛋白质。
[0026] 所述严格条件可为用0. 1 X SSPE或0. 1 X SSC，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 杂交实验中65°C下杂交并洗膜。
[0027] 扩增所述内切几丁质酶PbChi70基因全长或其任一片段的引物对，也属于本发明 的保护范围。
[0028] 含有所述PbChi70基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌，也属于本发明的保 护范围。
[0029] 所述重组载体具体可为在pET28a(+)的BamH I和Xho I酶切位点间插入所述内 切几丁质酶PbChi70基因得到的重组表达载体。
[0030] 所述重组菌是将所述的重组载体导入大肠杆菌得到的重组大肠杆菌。
[0031] 本发明所提供表达所述内切几丁质酶PbChi70蛋白的方法，是将上述所得的重组 菌发酵培养，得到蛋白。
[0032] 所述发酵培养的条件是：培养温度是37°C，培养至0D_达到0. 6~0. 8,加入终浓 度ImM异丙基硫代-β -D-半乳糖苷（IPTG)，30°C培养过夜。
[0033] 上述方法还包括将所述内切几丁质酶进行纯化的步骤，所述纯化包括以下步骤：
[0034] 1)将所述重组菌破壁；
[0035] 2)取上清液用Ni-IDA或Ni-NTA亲和层析进行纯化。
[0036] 3)检测各个纯化步骤中收集样品的蛋白浓度及酶的纯度。
[0037] 用本发明提供的几丁质酶可以水解胶体几丁质，所述蛋白质在水解几丁质生产几 丁二糖中的应用，也属于本发明的保护范围之内。
[0038] 本发明从巴伦葛兹类芽孢杆菌（Paenibacillus barengoltzii)中扩增得到几 丁质酶编码基因，并转入大肠杆菌中，实验结果表明，本发明的几丁质酶最适反应温度为 55°〇，在温度低于551：条件下处理3〇 1^11，残余酶活力达90%以上，表现出较好的热稳定 性；其最适pH为5. 5 ;用本发明提供的几丁质酶可以水解胶体几丁质，水解产物主要为几丁 二糖及少量单糖。几丁二糖采用活性炭色谱层析分离经结晶后得到晶体，产率可达61 %，纯 度达到99%。水解反应条件温和，对环境友好。
[0039] 利用本发明提供的几丁质酶制备几丁二糖，转化率高，能源消耗少，无污染物产 生，具有重要的经济价值。此外，本
【发明内容】
对促进海洋资源的利用及酶制剂工业的发展也 具有重要意义。
【附图说明】
[0040] 图1为本发明的几丁质酶基因 PbChi70保守区（A)和基因全长（B)PCR扩增产物 琼脂糖凝胶电泳图。
[0041] 图2为经各步骤纯化后几丁质酶PbChi70的SDS-PAGE电泳图，泳道Μ为低分子量 标准蛋白；泳道1为破壁后的粗酶液；泳道2为纯化后的几丁质酶。
[0042] 图3为纯化后几丁质酶的最适pH(Α)及pH稳定性（Β)，图中：（?)柠檬酸盐缓冲 液，（·）乙酸钠缓冲液，（□ )MES缓冲液，（▲)磷酸盐缓冲液，（Λ )Tris盐酸缓冲液， (〇）Glycine-NaOH 缓冲液，（? )Na2HP04-Na0H 缓冲液。
[0043] 图4为纯化后几丁质酶的最适温度（A)及温度稳定性（B)。
[0044] 图5为几丁质酶水解胶体几丁质产物的TLC分析图。Μ :几丁寡糖标准品；其它水 解时间图上已列出。
[0045] 图6为几丁质酶水解几丁寡糖产物的TLC图。Μ :几丁寡糖标准品；其它水解时间 图上已列出。
[0046] 图7为几丁质酶水解胶体几丁质制备几丁二糖的水解历程图。图中：（? )Ν_乙 酰氨基葡萄糖，（)几丁二糖，（▲)几丁三糖。
【具体实施方式】
[0047] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0048] 下述实施例的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用材料如试剂、克隆表达载体、菌株以及发酵用原材料均可从商 业途径获得。
[0050] 下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得 到的。
[0051] 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0052] 本发明所依赖的遗传资源是巴伦葛兹类芽孢杆菌（Paenibacillus barengoltzii)CAU904,保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年8月20日，保藏号为CGMCCNo. 9530,分类 命名：巴伦葛兹类芽孢杆菌，原始来源是2011年10月采自南海的海水水样，直接来源与原 始来源相同。
[0053] 实施例1几丁质酶基因的发现
[0054] -、几丁质酶基因组保守区片段PCR扩增简并引物设计
[0055] 以巴伦葛兹类芽抱杆菌（Paenibacillus barengoltzii) CAU904为基因组模板， 根据GenBank数据库中报道的几丁质酶氨基酸序列，利用在线软件Block Maker (http:// blocks, fhcrc. org/blocks/blockmkr/make_blocks. html)搜索保守区。根据几丁质酶的保 守氨基酸序列，利用在线设计软件 C0DH0P(http://blocks, fhcrc. org/codehop. html),选 取GenBank中已报道的类芽孢杆菌属GH 18家族几丁质酶氨基酸序列进行同源比对，选择 序列保守区THINYAFA和DLDWEYPV设计表2中的简并引物Chi2DF和Chi2DR。
[0056] PCR反应条件：94°C预变性5min ;以94°C变性30s、62~52°C退火30s、72°C延伸 40s为一个循环进行20个循环；以94°C变性30s、55°C退火30s、72°C延伸40s为一个循环 进行15个循环；72°C总延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳回收，用TA克隆试剂 盒连入PMD18-T载体中，转化E. coli DH5a，菌落PCR挑取阳性克隆测序，测序结果NCBI中 进行BLAST比对。以基因组DNA为模板扩增到一段412bp左右的片段，参见图1，测序结果 在NCBI中进行Blastx比对。
[0057] 表2几丁质酶PbChi70基因克隆引物表
[0058]
[0059] 表2中：下划线标注为限制性酶切位点；Y = C/T，N = A/G/C/T，R = A/G
[0060] 二、几丁质酶基因全长PCR扩增
[0061] 比对结果显示，步骤一获得的保守片段的氨基酸序列，据