内切几丁质酶及其编码基因和在生产几丁二糖中的应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种几丁质酶基因。更具体地涉及一种内切几丁质酶基因及其在制备几丁二糖中的应用。属于生物工程领域。【
背景技术：
】[0002]几丁质（Chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1，4_糖苷键连接而成的不溶于水的线性多聚物(Bendtetal.Cloning,expression,andcharacterizationofachitinasegenefromtheAntarcticpsychrotolerantbacteriumVibriosp.strainFi:7.Extremophiles,2001，5:119-126)，是自然界中含量仅次于纤维素的可再生生物质，每年生物界合成的几丁质高达上百亿吨。几丁质广泛存在于虾、蟹、昆虫的甲壳以及真菌和植物的细胞壁中。几丁质及其衍生物，如几丁寡糖和壳聚糖等，由于在抗菌和抗肿瘤等方面具有较高的利用价值，近年来受到人们越来越多的重视。传统几丁质相关产品的生产主要是通过化学酸水解法来获得，生产过程对环境造成了较大的污染。酶催化水解几丁质制备几丁寡糖等产品是一种高效、环保的制备方法，该方法的关键是获得性能优良的几丁质酶。[0003]几丁质酶（Chitinase，EC3.2.1.14)是一类糖苷键水解酶，能够特异性地催化水解几丁质链中的β-1，4_糖苷键生成几丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖（Bhattacharyaetal.Bacterialchitinases:Propertiesandpotential.CriticalReviewsinBiotechnology，2007,27:21-28)。几丁质酶水解几丁质生成的几丁寡糖具有一些独特的功能特性，在食品、医药、化妆品和饲料等方面具有广泛的应用价值。如这些低聚糖具有清爽的甜味，在水中溶解度比单糖低，因此有助于调整食品中的水活性，且兼具调味和改良食品质构的功能；其次几丁寡糖还可促进肠道内益生菌的增殖，并抑制肠道病原菌的生长，是一种良好的双歧杆菌增殖因子；此外几丁寡糖的吸湿和保湿性好，可用作保湿乳液、化妆水的原材料。几丁质酶除了在几丁质生物转化中具有重要的作用，同时一些几丁质酶还具有抗菌活性，在农作物生物防治中也具有很大的应用潜力。[0004]关于几丁质酶的研究国内已有一些专利报道，如专利【申请号】201210510998.0，从柠檬酸杆菌中克隆得到了几丁质酶基因，并获得重组蛋白CHI-X;专利【申请号】201110258893.6,筛选得到一株产几丁质酶的细菌Chitiniphilushaikoumangrovensis，并利用该菌所产的几丁质酶降解胶体几丁质制备几丁寡糖。国际上关于细菌几丁质酶的研究报道相对较多，尤其是类芽孢杆菌属菌株，如Paenibacillussabina、Paenibacilluschitinolyticus、Paenibacillussp.Dl>Paenibacilluspabuli和Paenibacillussp.FPU-7等(Pateletal.StatisticaloptimisationofmediumcomponentsforchitinaseproductionbyPaenibacillussabinastrainJD2.AnnalsofMicrobiology,2007,57:589-597；Ahmadietal.Isolationandcharacterizationofachitionolyticenzymeproducingmicroorganism,PaenibacilluschitinolyticusJK2fromIran.JournalofMicrobiology,2008,3:395-404；SinghAK.OptimizationofcultureconditionsforthermostablechitinaseproductionbyPaenibacillussp.D1.AfricanJournalofMicrobiologyResearch,2010,4:2291-2298；Itohetal.Cooperativedegradationofchitinbyextracellularandcellsurface-expressedchitinasesfromPaenibacillussp.strainFPU-7.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2013,79:7482-7490)。国内仅见：嗜几丁质类芽抱杆菌菌株CH11几丁质酶特性研究.江苏农业科学，蒋志强等，2006,1:47-49,研究嗜几丁质类芽孢杆菌（Paenibacilluschitinolyticus)产几丁质酶的情况。目前国际上尚无巴伦葛兹类芽孢杆菌（Paenibacillusbarengoltzii)产几丁质酶的研究报道。[0005]几丁二糖是一种中间体，在合成各种复杂的活性寡糖及多糖中具有重要作用，但是其制备非常麻烦且价格昂贵。Matsuokaetal.AnimprovedpreparationofN,N'-diacetylchitobiosebycontinuousenzymaticdegradationofcolloidalchitinusingdialysistubingasaconvenientseparator.Biomacromolecules,2000,1:798-8〇〇,利用透析管作为分离装置连续酶解胶体几丁质产几丁二糖，其水解率达到36%。Cottazetal.GeneticengineeringofEscherichiacolifortheproductionofN1，Nn_diacetylchitobiose(chitinbiose)anditsutilizationasaprimerforthesynthesisofcomplexcarbohydrates.MetabolicEngineering,2005,7:311-317,应用根瘤霉几丁质酶水解几丁质制备几丁二糖，产量达到4g/L。Ilankovanetal·ProductionofN-acetylchitobiosefromvariouschitinsubstratesusingcommercialenzymes.CarbohydratePolymers,2006,63:245-250,应用商业几丁质酶水解不同几丁质底物生产几丁二糖，产物中几丁二糖的含量为71.5%，另含有19%几丁单糖和9.5%几丁三糖。已有的研究报道不仅几丁二糖的产率低，而且其含量也低，为后续分离纯化带来很大难度，因此制备技术有待进一步提商。[0006]国内关于几丁质酶的研究起步较晚，目前还没有实现产业化。能否获得产酶量高、酶学性质优异的几丁质酶，对于提高我国几丁质资源利用的效率具有重要意义。[0007]本发明从中国南海地区采集的海水样品中，筛选得到一株耐热细菌巴伦葛兹类芽孢杆菌，从该菌株中克隆得到一个几丁质酶基因并进行了异源表达，获得重组几丁质酶并研究了该酶的酶学性质，最后应用该重组酶水解几丁质制备高纯度几丁二糖。【
发明内容】[0008]本发明的目的在于提供一种内切几丁质酶，名称为PbChi70,来源于巴伦葛兹类芽孢杆菌（Paenibacillusbarengoltzii)。本发明的另一个目的是提供一种表达几丁质酶PbChi70蛋白的方法和在生产几丁二糖中的应用。[0009]本发明提供的内切几丁质酶PbChi70蛋白质，是如下1)~3)中的一种蛋白质：[0010]1)由序列表中序列2第40~696所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0011]2)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0012]3)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有几丁质酶活性的由1)衍生的蛋白质。[0013]所述衍生的蛋白质是指通过物理诱变、化当前第1页1 2 3 4