一种二萜化合物variediene合成基因Au13192及其应用_4

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min。
[0121] (9)将吸附柱转移到另一干净1.5mL塑料离心管中,在吸附膜的中央处悬空加入 50-100yL Buffer E后室温静置lmin,室温12000Xg离心lmin洗脱克隆子的质粒。
[0122] 将获得的质粒用美国New England Biolabs公司的高保真限制性内切酶Hindlll 和Notl双酶切(2yL Cutsmart buffer,0.5yL HindIII,0.5yL NotI,lyL质粒DNA,16yL ddH20,37°C处理2h)后,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,确定克隆子携带的外源DNA片段是否 是目的DNA片段。取lmL含有目的DNA片段的克隆子菌液送交北京擎科新业生物技术有限公 司测序,测序结果证实该克隆子的确含有目的DNA片段,目的DNA片段没有出现突变。将该阳 性克隆子的重组质粒命名为广-Blunt-Aul3192。
[0123] 实施例3Aul3192蛋白的表达和纯化
[0124] 1、含AU13192基因大肠杆菌表达载体的构建
[0125] 用限制性内切酶HindIII和N〇11从含有目的基因的重组质粒-B1 unt-Aul3192中切下目的片段,同时用Hindlll和Notl双酶切pET28a载体,琼脂糖凝胶电泳分离 后,用OMEGA胶回收试剂盒分别回收目的基因片段和pET28a载体的大片段。利用T4DNA连接 酶将Aul3192基因正向插入到pET28a载体中,将连接产物转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞, 经克隆子快速检验和质粒酶切验证鉴定后,获得大肠杆菌重组表达载体pET28a-Aul3192。
[0126] 将构建好的pET28a-Aul3192载体经热激转化法转入大肠杆菌BL21(DE3),进一步 验证Au 13192基因的功能。
[0127] 2、Aul3192基因的表达
[0128] 将重组质粒pET28a-Aul3192及pET28a质粒通过热激转化法分别转入表达宿主菌 大肠杆菌BL21(DE3)中,用武汉麦克莱博生物科技有限公司的质粒小量提取试剂盒对转化 子进行质粒抽提,经限制性内切酶Hindlll和Notl酶切验证鉴定,成功获得分别含重组质粒 pET28a-Aul3192及pET28a质粒的大肠杆菌表达菌株。
[0129] 分别挑取含重组质粒pET28a-Aul3192及pET28a质粒的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落 接种至含卡那霉素抗性(50yg/mL)的5mL LB培养基,于37°C、220r/min过夜培养。按1 %的接 种量将新鲜菌液接种至含卡那霉素抗性(50yg/mL)的5mL LB培养基中,继续培养2-3h至 0D6QQ达到0.4-0.6时,加入IPTG至终浓度为0.1 mM,于37°C下诱导培养约3-5h(诱导前分别取 出lmL菌液作为对照)。分别取出诱导前和诱导后的菌液200yL,加入5 X SDS-PAGE样品缓冲 液煮沸30min,室温12000 X g离心10min,各取10yL上清液进行SDS-PAGE检测,结果(图6)表 明目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达。
[0130] 3、Aul3192蛋白的纯化
[0131] 取5mL过夜培养的含重组质粒pET28a-Aul3192的大肠杆菌BL21(DE3)菌液按1%的 接种量接种至含卡那霉素抗性(50yg/mL)的500mL LB培养基中,于37°C条件下220r/min培 养至0D6QQ达到0.4-0.6时,加入IPTG至终浓度为0.1 mM,于37°C下诱导培养约3-5h。然后室温 5000r/min离心5min收集诱导表达后的大肠杆菌菌体,用无菌ddH2〇悬浮菌体,室温5000r/ min离心5min后去除上清(重复两次,彻底清洗细胞)。之后用HEPES缓冲液悬浮菌体,室温 5000r/min离心后去除上清。将10mL HEPES缓冲液加入菌体细胞中,充分混匀后将细胞悬液 置冰水浴中超声(参数:超声2s,间歇5s,功率300W)处理30min。然后4°C、13000rpm离心 60min,取上清液用0.45μηι滤膜过滤后进行蛋白纯化。纯化方法如下:
[0132] (1)取适量镍珠基质上柱,使基质里的无水乙醇在重力作用下充分流出。
[0133] (2)用20mL无菌ddH20冲洗柱子。
[0134] (3)用20mL HEPES缓冲液平衡柱子。
[0135] (4)将含有目标蛋白的上清液加入柱子中,收集流穿液,进行SDS-PAGE检测。
[0136] (5)分别以含25mM、50mM、75mM、100mM和250mM咪唑的洗脱液(用HEPES缓冲液稀释 的咪唑溶液)进行洗脱,收集流出液,进行SDS-PAGE检测。
[0137] SDS-PAGE检测结果显示用含75mM咪唑的洗脱液进行洗脱时,获得较纯的蛋白(图 7)。用lOkDa的超滤浓缩管浓缩该较纯的蛋白溶液至2.5mL后,用GE Healthcare的ro-ΙΟ脱 盐柱(货号为17-0851-01)对浓缩后的蛋白溶液进行脱盐处理,具体操作如下:
[0138] (1)用10mL平衡缓冲液平衡柱子,弃废液,重复4次。
[0139] (2)加入2.5mL蛋白液至完全浸入柱子,弃废液。
[0140] (3)加入3.5mL洗脱液并收集流出液(该流出液即为完成脱盐处理的蛋白溶液)-80 °C保藏备用。
[0141] 实施例4Aul3192蛋白的功能分析
[0142] 为了确定Aul3192蛋白的功能,以美国Sigma-Aldrich公司的DMAPP(二甲基烯丙基 焦磷酸)、GPP(香叶基焦磷酸)、FPP(法尼基焦磷酸)为底物,分别添加 IPP(异戊烯焦磷酸)来 设计体外反应。反应体系(200μL):50μΜ DMAPP(或GPP、FPP),50yM IPP,20mM HEPES(pH 7.4)、2mM DTT(二硫苏糖醇)、5mM MgCl2和lOOyg Aul3192蛋白,30°C反应3h。反应结束后, 用等体积正己烷萃取3次,用氮吹仪将有机溶剂吹干,50yL正己烷溶解后进行GC-MS(气相色 谱-质谱)检测。升温程序:60 °C恒温2miη,再以30 °C/min的速度升温到150 °C,再以10 °C /miη 的速度升温到180°C,再以2°C/min的速度升温到210°C,保持210°C5min。
[0143] 以DMAPP、GPP和FPP为底物,分别添加 IPP,在保留时间为12.7min时都检测到了分 子量为272的物质,该物质通过质谱图分析为二砲化合物variediene(m/z = 55、67、91、105、 119、133、147、203、230、257、272等)(图8)。
[0144] 以上结果表明Aul3192蛋白能用DMAPP、GPP和FPP为底物,分别添加 IPP时合成二萜 化合物variediene。由此可知Aul3192蛋白同时具有催化底物链长延伸和结构环化的功能, 能够以DMAPP从头合成variedienec^
【主权项】
1. 一种二祗化合物variediene合成酶,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所 示;所述的二祗化合物var i ed i ene的结构如下所示:2. 编码权利要求1所述二祗化合物variediene合成酶的基因,其特征在于:其基因序列 如沈Q ID NO. 1所示。3. 根据权利要求2所述的基因,其特征在于:其CDNA序列如SEQ ID NO.2所示。4. 一种表达权利要求1所述的二祗化合物variediene合成酶的载体,其特征在于:为含 有权利要求2或3所述基因的真核或原核表达载体。5. -种表达权利要求1所述的二祗化合物variediene合成酶的宿主细胞,其特征在于: 含有权利要求4所述的载体。6. 权利要求1所述的合成酶或权利要求2或3所述的基因在合成variediene中的应用。7. 权利要求1所述的合成酶或权利要求2或3所述的基因在制备祗类化合物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种二萜化合物variediene合成基因<i>Au13192</i>及其应用,属于基因工程领域。该二萜化合物合成基因来源于焦曲霉094102,其基因、cDNA序列如SEQ?ID?NO.1、2所示,其编码的Au13192蛋白的序列如SEQ?ID?NO.3所示。Au13192蛋白具有催化底物链长延伸和结构环化的功能,该蛋白能催化DMAPP、GPP和FPP与IPP反应生成variediene。本发明发现了<i>Au13192</i>基因在焦曲霉094102体内对蛇孢假壳素类化合物产量有显著影响,其可用于辅助制备Oph化合物。本发明为Oph化合物的生物合成提供了新的资源,为提高该类化合物的生物产量提供一种可能性。
【IPC分类】C12N15/52, C12P15/00, C12N9/00
【公开号】CN105647879
【申请号】
【发明人】洪葵, 殷如, 柴沆镇, 董治统, 邓子新
【申请人】武汉大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年3月16日
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