一种二萜化合物variediene合成基因Au13192及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种从焦曲霉094102(Aspergillus ustus 094102)中克隆得到的二砲化合物￥&1^6(116116合成基因41113192及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛇孢假壳素(Ophiobolin，以下简称Oph)是一类具有5-8-5三环结构的二倍半砲， 到目前为止发表的具有5-8-5三环母核结构的蛇孢假壳素类化合物主要有蛇孢假壳素 A、C、 F、H、M、L(M.ORSENIGO.Estrazione e purificazione della cochliobolina，una tossina prodotta da Helmintosporium 〇^2&6.卩117如卩&也.2.1957,29，189-196)、蛇抱假壳素0、 Q、R、S(CL Tipton，T Tovrea,G Whitehurst.The effect of ophiobolin A on glucose uptake by animal 〇6118.?^1^1'.1^口.11^.23,723-727(1981))等。二倍半碗由五个异戊二 烯单元组成，是萜类化合物中的稀有类型，只占萜类总数不到2%。目前还没有二倍半萜类 的药物，但一些二倍半萜化合物表现出了良好的生物活性。该类化合物显示广谱的抗菌活 性(如抗真菌、抗细菌)和抗线虫、抗病毒等活性，此外还对多种肿瘤细胞株具有显著细胞毒 活性(Au，T.K.，Chick，W.S.H.&Leung，P.C.The biology of ophiobolins .Life Sci .67, 733-742(2000))。
[0003] Oph A作为首个被发现的Oph化合物，除具有多种生物活性外，还是一种重要的钙 调蛋白抑制剂，可以作为探针（Leung，P.C.，Taylor，W.A.，Wang，J.H.&Tipton，C.L.Role of calmodulin inhibition in the mode of action of ophiobolin a.Plant Physiol.77, 303-308(1985);Peters，C.&Mayer，A.Ca2+/calmodulin signals the completion of docking and triggers a late step of vacuole fusion.Nature·396，575-80(1998))〇 最新的研究表明〇ph A在脑胶质瘤和帕金森病的治疗中有潜在应用（Dasari，R.et al.Fungal metabolite ophiobolin Aas a promising anti-glioma agent: In vivo evaluation,structure-activity relationship and unique pyrrolylation of primary amines.Bioorg Med Chem Lett.25,4544-4548(2015)；Xue,D.et al.3-anhydr〇-6-hydroxy-ophiobolin A,a fungal sesterterpene from Bipolaris oryzae induced autophagy and promoted the degradation of α-synuclein in PC12cells.Bioorg Med Chem Lett. 25,1464-1470(2015))。华北制药集团新药研究开发中心曾测试过Oph G和Oph K对人结肠癌细胞株Hct-15/Hct-116;人乳腺癌细胞株MDA-MB-231/MCF-7、人肺癌细胞株 A549和人白血病细胞K562的抑制作用，发现这两种化合物对上述癌细胞的IC5Q均低于30ug/ mL并呈较好的量效关系(朱京童，范玉玲，路新华，董悦生，郑智慧，张华，贺建功.二倍半萜 类化合物蛇孢菌素抗肿瘤活性的体外实验研究.《癌变?畸变?突变》，2007,19(5):388-391)。有研究发现Oph 0可以增加阿霉素耐药的乳腺癌细胞的敏感性，Ο.ΙμΜ Oph 0与阿霉 素联合用药，可以使耐药细胞的阿霉素 IC50从74.00±0.18μΜ降低到6.67±0.98μΜ，降低约 11倍(Sun，W.et al.0phiobolin-〇 reverses adriamycin resistance via cell cycle arrest and apoptosis sensitization in adriamycin-resistant human breast carcinoma(MCF_7/ADR)cells.Mar Drugs·11,4570-84(2013))〇
[0004] 由于Oph化合物在药物开发中的良好前景，大量制备化合物是一个重要的前提。从 1992年开始陆续有关于蛇孢假壳素类化合物及其母核化学合成的报道，但该类化合物的复 杂结构使其化学合成的研究极具挑战性，到目前仅完成了蛇孢假壳素 A的全合成(Kazuhiro Tsuna,Naoyoshi Noguchi,Masahisa Nakada.Enantioselective total synthesis of ( + )-〇phiobolin A.Chemistry-A European Journal.2013,19,5476-5486；Ke Li ,Cheng Wang,Gang Yin,et al.Construction of the basic skeleton of ophiobolin A and variecolin.Organic&Biomolecular Chemistry.2013,11,7550-7558)，而且合成步骤繁琐 不易操作，因此利用生物合成法制备〇ph是获得大量化合物的重要途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的首要目的在于提供一种二萜化合物variediene合成基因，二萜化合物 variediene的结构如图1所示。本发明的另一目的在于提供一种二砲化合物variediene合 成酶。本发明的再一目的在于所述基因或酶的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0007] 在研究焦曲霉094102(CCTCC Ν0:Μ 208153)代谢产物Oph化合物的生物合成过程 中，本发明通过敲除与萜类化合物合成相关的基因簇，检测〇ph化合物的产量变化，发现 P0C13192基因簇（图2)的敲除使Oph化合物产量与野生型在相同培养条件下相比显著降低 (图3 )，表明P0C13192基因簇影响Oph化合物的合成。通过对基因簇基因功能分析，得知在 P0C13192基因簇中Aul3192基因与萜类合成相关，说明在P0C13192基因簇中Aul3192基因参 与了 〇ph化合物的生物合成。进一步通过异源表达AU13192基因获取AU13192蛋白进行体外 酶促反应验证了Aul3192基因是一种二砲化合物variediene的合成基因。
[0008] -种二砲化合物variediene合成基因，为从焦曲霉094102中克隆得到的Au 13192 基因，其基因序列如SEQ ID N0.1所示。所述的Aul3192基因含有8个内含子，其cDNA大小为 2127bp，序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009] -种二砲化合物variediene合成酶，即为Aul3192基因编码的蛋白，命名为 Aul3192蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID勵.3所示。六1113192蛋白具有催化底物链长延伸和结 构环化的功能，Aul3192蛋白能催化DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸）、GPP(香叶基焦磷酸）或 FPP (法尼基焦磷酸)与IPP反应合成variediene。
[0010] 本发明所述的Aul3192蛋白可通过大肠杆菌原核表达系统对Aul3192基因进行异 源表达得到，同时可通过镍离子金属螯合亲合层析得到纯化的AU13192蛋白。
[0011] 一种表达上述AU13192蛋白的载体，含有上述Aul3192基因的真核或原核表达载 体。
[0012] 一种表达上述Aul3192蛋白的宿主细胞，含有上述载体。
[0013] 基于Aul3192蛋白可以合成二砲化合物variediene，能够辅助Oph化合物母核合 成，上述Aul3192基因或Aul3192蛋白可用于合成二砲化合物variediene、合成砲类化合物、 辅助合成〇ph化合物(蛇孢假壳素类化合物）。
[0014]本发明具有如下有益效果:本发明发现了合成二砲化合物variediene的Aul3192 基因，其编码的Aul3192蛋白能够辅助Oph化合物母核合成。本发明为Oph化合物的生物合成 提供了新的资源，为提高该类化合物的生物产量提供一种选择。在Oph化合物的生物合成 中，通过共表达Aul3192基因能够提高Oph化合物的产量。
【附图说明】
[0015] 图1是二ijjg化合物variediene的结构图。
[0016] 图