[0065] (5)用2倍体积的乙酸乙酯萃取1次，用旋转蒸发仪旋干后用15mL甲醇（色谱级）溶 解。
[0066] (6)取lmL甲醇溶液，经0.22μπι滤膜过滤后置于色谱瓶中，即为HPLC样品。
[0067] (7)将样品进行冊^：-1^检测：进样1(^1^，流速1111171^11，全波长检测，人 111￡? = 230- 240nm，流动相为甲醇：水=85:15 (v/v)，冲洗30min，time = 8_30min。
[0068] (8)根据标准曲线计算oph产量：y = 3E+07x_76040 [R2 = 0.995](Waters) ;y = 65482x+17.89[R2 = 0.998](Agilent) 〇
[0069] 通过野生型焦曲霉094102与P0C13192缺失突变株AP〇C13192oph产量比较，表明 P0C13192的缺失降低了 Oph产量(图3)。
[0070] 为进一步验证说明P0C13192对oph产量的影响，下面对P0C13192基因簇的核心基 因 AU13192进行异源表达，体外验证该基因功能。
[0071] 实施例2Aul3192基因克隆
[0072] 1、焦曲霉094102菌株的DNA提取
[0073] (1)将焦曲霉094102菌液涂布于GMM平板上，28°C培养3d左右。
[0074] (2)从GMM培养平板上挑取适量的孢子，悬浮于lmL ddH20至浑浊，涡旋仪震荡使混 勾。12000rpm离心2min，收集孢子，倒掉上清。
[0075] (3)加入Bufferl 0.4mL，混匀。Bufferl:50mM Tris-Hcl，10mM EDTA，100yg RNaseA，pH 8·0〇
[0076] (4)加入Buffer2 0 · 4mL，混匀后65 °C 孵育20min，冷却至室温。Buffer2 : 200mM NaoH,l%SDS〇
[0077] (5)加入Buf f er3 0 · 6mL，混勾后12000rpm离心1 Omin，转移上清至新的1 · 5mL离心 管。Buffer3:3M醋酸钾，pH 5.5。
[0078] (6)加入1/8倍体积的3M NaAc(pH5 · 2)和0 · 6~0 · 8倍体积的异丙醇，4°C冰箱放置 30min〇
[0079] (7)12000rpm 离心 20min，倒掉上清。
[0080] (8)用70%乙醇0.6mL洗两次，12000rpm离心2min，倒掉上清。
[0081] (9)干燥后溶于无菌水10yL，-40°C保存备用。
[0082] 2、Aul3192 基因 cDNA 的扩增
[0083] Aul3192基因有9个外显子(E1~E9)，采用Over-lap PCR的方法将9个外显子拼接 起来获取Aul3192基因 cDNA。设计引物使每个相邻片段之间有18-22bp的重叠区，其中E2、E7 片段较小，将其序列设计到相邻片段的引物中扩增出来(图5)。
[0084] (1)以焦曲霉094102基因组为模板，利用各个片段的引物（表2)分别扩增获取 Aul3192基因的9个外显子片段El、E3、E4、E5、E6、E8、E9。反应体系为：lμL美国NewEngland Biolabs公司的Pfu高保真DNA聚合酶，32yL灭菌去离子水，10yL Pfu高保真DNA聚合酶自带 的5父陬131^6广正向、反向引物各2.5以1^(1(^]\〇，焦曲霉094102基因组模板24匕
[0085] 表2扩增Aul3192基因外显子的引物
[0086]
[0088] (2)分别取lyL E1、E3片段为模板，以E1F、E3R为引物，在Pfu高保真DNA聚合酶作用 下扩增得到E1:E3。
[0089] (3)分别取lyL E4、E5片段为模板，以E4F、E5R为引物，在Pfu高保真DNA聚合酶作用 下扩增得到E4:E5。
[0090] (4)别取lyL E6、E8、E9片段为模板，以E6F、E9R为引物，在Pfu高保真DNA聚合酶作 用下扩增得到E6:E9。
[0091] (5)别取lyL El:E3、E4:E5、E6:E9片段为模板，以ElF、E9R为引物，在Pfu高保真DNA 聚合酶作用下扩增得到Aul3192基因 cDNA。
[0092] PCR扩增条件为：95 °C预变性3min; 95 °C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸60s，35个 循环;72°C充分延伸lOmin。
[0093] 3、目的DNA回收
[0094] PCR产物电泳后，使用德国OMEGA公司的Gel Extraction Kit(lOO)(货号：D2500-01)，从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段。具体操作步骤如下：
[0095] (1)使用三羟甲基氨基甲烷-乙酸(简称为TAE)缓冲液制作1.0%的琼脂糖凝胶，对 目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
[0096] (2)在紫外灯下切下含有目的DNA片段的凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体(此时 应尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率）。
[0097] (3)切碎胶块(胶块切碎后可以加快胶块融化时间，提高DNA回收率）。
[0098] (4)称量胶块重量，计算胶块体积。按每100mg琼脂糖凝胶400yL的比例加入 Binding buffer，50-60°C处理约10min(每隔2min混勾一次，直至胶块完全融化）。
[0099] (5)将融化的胶溶液转移到收集管的吸附柱内，室温10000 X g离心lmin，弃滤液。
[0100] (6)加入500yL XP2(Binding buffer)至吸附柱中，室温 10000 X g离心lmin，倒掉 收集管中的滤液，将吸附柱放回到收集管中。
[0101] (7)加入700yL SPW(Wash buffer)至吸附柱中，室温10000Xg离lmin，倒掉收集管 中的滤液，将吸附柱放回到收集管中。
[0102] (8)加入300yL SPW(Wash buffer)至吸附柱中，室温10000 Xg离心lmin，倒掉收集 管中的滤液，将吸附柱放回到收集管中。
[0103] (9)室温 10000Xg 开盖离心 2min。
[0104] (10)将吸附柱放入另一干净的1.5mL塑料离心管中，在吸附柱模的中央处加入30-50yL Elution buffer或无菌水，室温放置2_5min后室温10000Xg离心lmin。
[0105] (11)回收产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳检验。
[0106] 4、目的DNA的克隆
[0107]回收的目的DNA于16°C与pEASY-Blunt载体连接2-4h，连接产物转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，过夜培养后采用快速检验的方法初步筛选阳性克隆子，方法如下：
[0108] (1)用无菌牙签在转化平板上挑取约20个单克隆子，在含有氨苄抗性（10〇yg/mL) 的LA平板上划线，于37 °C培养8h。
[0109] (2)在 1.5mL塑料离心管中加入30yL STE溶液（20mM Tris-HCl，25mM EDTA，75mM NaCl)，用牙签将扩大培养后的单克隆子分别挑取到上述塑料离心管中涡旋处理约2min，使 其充分混匀。
[0110] (3)加入等体积氯仿:酚:异戊醇(V: V: v = 24:25:1)，轻摇混匀后，室温10000 X g离 心5min〇
[0111] (4)上清液用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，初步确定克隆子含有的质粒是否插入外 源片段。
[0112]用武汉麦克莱博生物科技有限公司的质粒小量提取试剂盒对含有外源片段的克 隆子进行质粒抽提，具体操作如下：
[0113] (1)将单克隆子接入含氨苄抗性（100yg/mL)的5mL LB培养基中，于37°C条件下， 220r/min过夜培养后转移2mL菌液至2mL塑料离心管中，于室温12000 X g离心lmin，弃上清。
[0114] (2)加入250yL Bufferl，于漩涡振荡器上剧烈震荡，使菌体充分重悬。
[0115] (3)加入250yL Buffer2,温和颠倒离心管5-6次，直到体系变清亮为止。
[0116] (4)加入350yL Buffer3,温和颠倒离心管3-5次以充分混匀。
[0117] (5)室温12000 Xg离心10min，将上清液小心转入收集管的吸附柱中，室温12000 X g离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放回收集管。
[0118] (6)加入500yL Buffer D，室温12000 Xg离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附 柱放回收集管。
[0119] (7)加入600yL Buffer W，室温12000 Xg离心lmin，倒掉收集管中的液体，将吸附 柱放回收集管。
[0120] (8)再次加入300yL Buffer W，室温 12000Xg离心l