2是焦曲霉094102的P0C13192基因簇图。
[0017] 图3是焦曲霉094102P0C13192基因簇敲除突变株Δ P0C13192与野生型Oph化合物 产量的比较图。
[0018] 图4是焦曲霉094102Aul3192基因编码的蛋白Aul3192与EvVS蛋白的氨基酸序列比 对结果图。
[0019] 图5是Aul3192基因 cDNA扩增策略图。
[0020] 图6是Aul3192基因异源表达蛋白的表达结果图。M:蛋白marker;l:含有pET28a载 体的BL21(DE3)在IPTG诱导前的全细胞蛋白图；2:含有pET28a载体的BL21(DE3)在IPTG诱导 后的全细胞蛋白图；3:含有pET28a-Aul3192载体的BL21(DE3)在IPTG诱导前的全细胞蛋白 图；4:含有pET28a-Aul3192载体的BL21(DE3)在IPTG诱导后的全细胞蛋白图。
[0021] 图7是AU13192基因异源表达蛋白的纯化结果图。
[0022] 图8是Aul3192蛋白体外反应产物的GC-MS图。A:质荷比为272下提取的体外反应产 物GC色谱图（I:以FPP和IPP为底物的反应产物GC色谱图；Π :以GPP和IPP为底物的反应产物 GC色谱图；ΙΠ :以DMAPP和IPP为底物的反应产物GC色谱图；IV:以IPP为底物的反应产物GC色 谱图）;B:体外反应产物质谱图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，下述实施例仅用来说明本发 明，并不限制本发明的范围。
[0024]本发明所提供的二砲化合物variediene合成基因，是从焦曲霉094102 (Aspergillus ustus094102)中克隆得到，命名为Aul3192基因，其基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。Aul3192基因含有8个内含子，其cDNA大小为2127bp，序列如SEQIDN0.2所示。 Aul3192基因编码的蛋白，命名为Aul3192蛋白，其氨基酸序列如SEQIDN0.3所示。
[0025]从公共数据库上搜索焦曲霉094102Aul3192蛋白的同源序列进行比对，结果显示 目标蛋白Aul3192与来自Emericellavariecolor的EvVS(variediene合成酶）（BinQin， Yudai Matsuda,Takahiro Mori,et al.An Unusual Chimeric Diterpene Synthase from Emericella variecolorand Its Functional Conversion into a Sesterterpene Synthase by Domain Swapping.Angew.Chem.Int.Ed.54,1-5(2015))同源性较高（78%)〇 Aul3192蛋白属于嵌合型萜类合成酶，其N端和C端分别负责萜类环化和异戊烯基转移功能。 AU13192蛋白含有两个保守结构域，其中萜类环化酶结构域含有两个用来识别Mg2+和底物的 特征性保守基序DNVVE和NDYFSFDIE，E-IPPS结构域也含有两个具有相似功能的特征性保守 基序 DDIED 和 DDYKN(图 4)。
[0026]实施例1P0C13192基因簇的敲除
[0027]利用同源重组的方法，将焦曲霉094102菌体中的P0C13192基因簇替换成博来霉素 抗性基因，检测突变株中Oph含量的变化情况。本实施例所用到培养基配方如表1。
[0028]表1:本实施例所用到培养基配方
[0029]
[0031] l、P〇C13192基因簇敲除载体的构建
[0032] (1)通过PCR技术，以pGAPZaA载体为模板扩增得到含有Ptefl和Pem7启动子的博来 霉素基因序列(Sh ble)。
[0033] 扩增所用到的引物序列：Sh ble-F:CCCACACACCATAGCTTCAAAAT;Sh ble-R: AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG。
[0034] (2)将扩增得到的片段通过ΤΑ克隆与pMD18-T载体连接，构建pMD18-T-Sh ble载 体，该载体Sh ble两侧有两个多克隆位点，分别用于添加 P0C13192基因簇上下同源序列。 [0035] (3)连接产物转化到大肠杆菌T0P10中，通过氨苄青霉素筛选阳性转化子。液体培 养阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pMD18-T-Sh ble质粒。
[0036] (4)以焦曲霉094102基因组为模板，在P0C13192基因簇上游扩增出1226bp的序列， 加入适当的酶切位点。
[0037] 扩增所用到的引物序列：？0(：131921^冲:6厶厶1'1'(7^厶(：1'1^厶厶厶1^厶606厶66厶^(3〇1?1) ; P0C13192L-R：TCTAGAATACCCACGGACCCAAC(XbaI)〇
[0038] (5)将扩增得到的P0C13192基因簇上游片段与pMD18-T-Sh ble载体连接，构建 pMD18-T-13192L-Sh ble载体。
[0039] (6)连接产物转化到大肠杆菌T0P10中，通过博来霉素筛选阳性转化子。液体培养 阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pMD 18-T-13192L-Sh b 1 e质粒。
[0040] (7)以焦曲霉094102基因组为模板，在P0C13192基因簇下游扩增出1077bp的序列， 加入适当的酶切位点。
[0041] 扩增所用到的引物序列：卩0(：131921?-卩：(：(^^^^66厶6〇厶6〇厶1'(：1'1^6厶1766(5匕^) ; P0C13192R-R:AAGCTTATTCTGGGACAGGAACTAG(HindIII)。
[0042] (8)将扩增得到的P0C13192基因簇下游片段与pMD18-T-13192L-Sh ble载体连接， 构建pMD18-T-13192L-Sh ble-13192R。
[0043] (9)连接产物转化到大肠杆菌TOPI0中，通过博来霉素筛选阳性转化子。液体培养 阳性转化子，提取质粒PCR验证，获取pMD18-T-13192L-Sh ble-13192R载体。该载体即用于 P0C13192基因族的敲除。
[0044] 2、原生质体的转化
[0045] (1)将焦曲霉094102菌株涂于GMM平板，28 °C培养3-4d。
[0046] (2)收集孢子于10mL 0.1%Tween-80(-般需要收集4个平板的孢子），用血球计数 板计数。
[0047] (3)接种约 109个孢子于500mL LMM中，28°C、280rpm培养约9h。
[0048] (4)用miracloth滤布过滤LMM培养物，4°C、8000rpm离心15min收集萌发的孢子，用 50mL Mycelium wash solution洗一次。
[0049] (5)将抱子沉淀移至含有1 %Driselase的Osmotic medium中，28°C、80rpm培养4h， 每隔l/2h用显微镜观察原生质体形成状况。
[0050] (6)用miracloth滤布过滤原生质体，加入2倍体积的STC buffer，4°C、6000rpm离 心8min收集原生质体。
[0051 ] (7)将原生质体重悬于STC buffer中，使其终浓度达到108-109个原生质体/mL。
[0052] (8)冰上保存原生质体，取出一部分稀释10倍进行原生质体计数，其他的尽快进行 PEG4000介导的原生质体转化实验。
[0053] (9)用STC buffer稀释待转化的敲除质粒(pMD18-T-13192L-Sh ble-13192R)，使 其终浓度达到l〇yg/l〇〇yL。
[0054] (10)将100yL含有敲除质粒的STC buffer加入到100yL原生质体中，充分混匀后冰 浴50min〇
[0055] (11)加入 1.25mL PEG solution，轻柔混匀后室温放置20min。
[0056] (12)加入5mL STC buffer，混勾后4°C、3750rpm离心 10min，弃上清。
[0057] (13)轻柔加入STC buffer并定容至600yL。
[0058] (14)取200yL转化后的混合物涂布于SMM(Zeo+)平板上，28°C培养3-5天。
[0059] (15)将长出的转化子进行PCR验证，阳性转化子即为P0C13192缺失突变株Δ P0C13192。
[0060] 3、0ph 的检测
[0061 ] (1)接种野生型焦曲霉094102或AP0C13192孢子于真菌2号培养基，28°C培养3d。
[0062] (2)接种菌液于固体发酵培养基，20°C培养18d。
[0063] (3)取20g发酵产物，加入30mL 80%丙酮后用破碎机破碎。
[0064] (4)超声破碎20min后，8000rpm离心10min，取上清。