检测到特异性ELISA抗体，S/N值大于2.1，表明免疫组 EMCV特异性抗体检测为阳性。从接种不同抗原剂量免疫组中可看出，ELISA抗体效价具有明 显的抗原剂量依赖性关系，最高可达1:400，10 7和106免疫组与104免疫组相比显著性差异(P 〈0.05)。接种相同佐剂不同抗原的免疫组ELISA抗体效价没有显著差异(P>0.05)，与对照组 相比差异极显著(P〈〇. 05)(图12)。加强免疫后各免疫组ELISA抗体水平显著提高，与对照组 相比差异性显著;接种同一种佐剂不同抗原组以及同一种抗原不同佐剂组之间ELISA抗体 水平没有显著性差异(P〈〇.〇5)(图13)。说明两种灭活病毒都能引起机体产生良好的免疫反 应。
[0184] 6.4中和抗体的测定
[0185] 将小鼠血清置于56°C水浴灭活30min，每3-5min摇晃几次，确保补体彻底灭活。然 后12000rpm离心10min，取上清并过滤，用含2 %胎牛血清的DMEM培养液将其稀释成1: 2、1: 4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128;同时也将EMCV NJ08病毒稀释为200TCID5〇/100yL。最后将上 述不同稀释度的血清和已稀释的病毒等体积混合，用涡旋仪混匀后，于37°C作用lh。将其接 种于已长满BHK-21细胞单层的96孔细胞板，每孔100yL，每个血清稀释度重复4孔，同时设立 只接种EMCV NJ08的阳性对照孔、正常细胞阴性对照孔和阴性血清对照孔。37°C继续培养 48h，观察并记录CPE情况，按照Reed-Muench法计算中和抗体滴度，并使用Spass软件分析比 较各组之间是否存差异。
[0186] 结果见图14,表明接种不同剂量rNJ08灭活疫苗组中和抗体也具有剂量依赖性关 系，其中，1〇7和1〇 6免疫组与1〇4免疫组相比差异性显著（P〈〇. 05)。不同佐剂相同剂量的 rNJ08与NJ08灭活疫苗组中和抗体效价均值在1:16以上，且各组之间差异性不显著（P> 0.05)，与对照组相比差异极显著(P〈0.05)。其中ISA206佐剂免疫组诱导中和抗体水平高于 ISA15A佐剂免疫组，说明ISA206佐剂效果更好。
[0187] 6.5淋巴细胞增殖转化试验
[0188] 将小鼠研究采血后断颈处理，置于含75%乙醇中消毒，在无菌超净台中取其脾脏， 放入装有无菌滤网的平皿中，加入适量的PBS溶液。用高压处理的弯针头将脾脏挤压、研磨 均匀。先将5mL的人淋巴细胞分离液加入10mL的离心管中，再缓慢加入等体积的脾脏匀浆液 体，保证淋巴分离液与脾脏匀浆液分层清晰。1500rpm水平离心15min，用注射器吸取中间云 雾状的白色淋巴细胞层，置于新的离心管中，加入适量红细胞裂解液，1500rpm离心10min。 弃上清，加入适量的含10 %FBS的1640营养液，用巴氏吸管轻柔吹打，重悬淋巴细胞， lOOOrpm离心10min。弃上清，加入lmL含10%FBS的1640营养液，然后进行细胞计数。将淋巴 细胞浓度调为5X10 6个/mL，加入96孔细胞板中，每孔100yL，每个样品铺12孔，静置4h使细 胞沉淀底部;然后分别加入l〇〇TCID 5Q的灭活病毒液(NJ08)100yL、加入终浓度为10yg/mL的 C〇A作为阳性对照以及100μΙ含10 % FBS的1640营养液作为阴性对照，各重复4孔。37 °C静置 培养66小时后，每孔加入100yL DMS0，摇晃使结晶溶解完全，测定OD57〇nm值。计算SI值，即病 毒刺激孔的平均0D值与阴性对照0D值之间的比值，并分析各组间的差异性。
[0189]结果见图15，表明接种不同剂量rNJ08灭活疫苗组刺激指数具有剂量依赖关系，但 各组之间差异性不显著(P>〇.〇5);接种相同剂量不同佐剂的rNJ08与NJ08灭活疫苗组之间 刺激指数均在3.0左右，且各组之间差异性不显著(P>0.05)。但与对照组相比，差异性显著 (Ρ〈0·05)。
[0190] 6.6病理学观察
[0191] 死亡小鼠剖检时主要观察心脏及脑组织是否有坏死、水肿等病变;统计各组小鼠 发病死亡状况。病死小鼠及存活小鼠剖检时采集心脏、脑组织固定放于4%多聚甲醛缓冲溶 液中，固定24h后按常规方法进行组织切片的制作，用于组织病理学观察。结果如图18、19所 示，发病小鼠的脑组织出现淋巴细胞浸润、小胶质细胞增生等典型的非化脓性脑炎症状;发 病小鼠心肌纤维出现坏死、空泡化，淋巴细胞渗出性炎症;耐过小鼠组织没有病变迹象。各 佐剂疫组发病死亡小鼠的病理变化程度相似，不同死亡时间小鼠的组织病程度变略有不 同，急性死亡小鼠观察不到明显的组织病理变化。
[0192] 目前，灭活疫苗因具有安全性高、容易获得且具有一定的免疫效果的特点。Gomez 等人成功研制出首例EMCV灭活疫苗，对妊娠母猪、仔猪和育肥猪进行攻毒保护试验，结果表 明都具有很好的保护效果。Ma t s umo r i等人利用研制的活疫苗免疫小鼠可使小鼠免受EMC V 的感染，获得100%的保护效果。这说明灭活疫苗具有较好的免疫和保护效果。灭活疫苗的 制备第一步是以最低浓度的灭活剂、最短时间将病毒灭活，保持最佳的抗原性，也是最关 键的环节。佐剂可以提高抗物质的抗原性，从而增强机体的免疫应答反应，对灭活疫苗具有 重要作用。
[0193] 本研究采用ΒΕΙ烷化剂类灭活剂，通过破坏病毒核酸使其不能复制，丧失侵染宿主 的能力，同时又不会损坏病毒衣壳蛋白，而保持良好的免疫原性，能够激发机体的免疫应答 反应。ΒΕΙ对宿主有毒害作用，可用终浓度为2%硫代硫酸钠处理，使其失活，减弱疫苗的副 作用。本实验选用了 ISA15A双相油佐剂和ISA206乳佐剂配制疫苗。试验结果表明从抗体水 平角度分析，灭活的rNJ08和NJ08都能有效地引起机体体液免疫反应并产生相应的ELISA抗 体和中和抗体;这也表明了两种灭活疫苗具有良好的免疫原性，能够引起机体产生体液免 疫和细胞免疫；ISA15A和ISA206两种佐剂效果良好，未出现不良反应，安全性高，对增强两 种灭活病毒的免疫原性发挥重要作用，其中ISA206佐剂效果略优于ISA15A佐剂。由于本研 究中使用的重组病毒rNJ08与亲本病毒NJ08在基因组序列上仍然有细微的差别，在体外的 生长特性相似，但是rNJ08对小鼠的致病性却很弱，这表明该病毒制备成灭活疫苗具有安全 性更高的优势。
[0194] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限 制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为 等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一株低毒力重组猪源脑屯、肌炎病毒，是通过W下步骤构建得到的： (1) 提取猪源脑屯、肌炎病毒株总RNA，RT-PCT扩增目的基因片段，扩增用引物如下^W猪源脑屯、肌炎病毒总RNA作为模板，^43、8诚、821?、^及0?1为特异性下游引物，构建 反应体系获得的A、Bi、B2、C片段的CDNA，分别W AF/AR，BiF/BiR，B2F/B2R，CF/CR2为引物，相应 的CDNA为模板进行PCR反应，获得A、Bi、B2、C四个片段，然后利用B1F/B2R为引物，将Bi和B2片 段进行融合反应，获得B片段； (2) 将A、B、C片段分别与祀asy-simple Blunt克隆载体进行连接，转化感受态细胞，培 养，提取阳性重组质粒，分别得到重组质粒祀asy-A、p化sy-B和祀as厂C; (3) 利用双酶切的方法将C、B、A片段依次克隆至载体中，构建病毒全长CDNA克隆， 得重组质粒PCMV-NJ08; (4) 将重组质粒PCMV-NJ08转染BHK-21细胞，经过培养得到猪源脑屯、肌炎病毒株感染性 克隆rNJ08。2. 根据权利要求1所述的低毒力猪源脑屯、肌炎病毒，其特征在于rNJ08接种BHK-21细 胞，连续传代，第3、5、10代捶救病毒的TCIDso为10 7'6?~IO8'5 TCI化o/mL。3. 根据权利要求1所述的低毒力猪源脑屯、肌炎病毒，其特征在于步骤(3)中利用双酶切 的方法将C、B、A片段依次克隆至载体中步骤如下： pEasy-C质粒用化Cl和SpeI双酶切，构建连接体系利用T4连接酶将片段C克隆至用同样 酶切处理的的载体CMV-0，22°C连接化，转化Trans I-Tl感受态细胞，获得的阳性质粒命名为 pCMV-C;然后pEasy-B质粒经化Cl和趾Ol双酶切，将酶切纯化后的B片段与化C巧日趾Ol双酶 切后的pCMV-C载体连接，获得阳性质粒命名为pCMV-BC;pEasy-A质粒用化C巧日化el双酶切， 酶切纯化后的A片段与化C巧日NheI双酶切后的pCMV-BC载体连接，将A片段连入pCMV-BC载体 中，获得阳性质粒命名为PCMV-NJ08。4. 权利要求1所述的低毒力猪源脑屯、肌炎病毒，其特征在于第6243位的T变成A，作为感 染性克隆的遗传标记。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的低毒力猪源脑屯、肌炎病毒，其特征在于猪源脑屯、 肌炎病毒为猪脑屯、肌炎病毒NJ08株。6. -种权利要求1-4中任一项所述的低毒力猪源脑屯、肌炎病毒在病毒捶救、病毒致弱 机理及利用该病毒的CDNA感染性克隆为载体插入不同病毒保护抗原基因、构建不同病毒 的嵌合病毒来表达外源蛋白W及由此开发出单价、双价或多价疫苗中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于将灭活的低毒力猪源脑屯、肌炎病毒使用 ISA15A和ISA206佐剂分别配制成灭活疫苗。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于ISAl5A佐剂与抗原体积比为1:4，ISA206佐 剂与抗原体积比为1:1。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于使用BEI浓度0.002mol/L、28°C作用24 h进 行灭活。
【专利摘要】本发明属于微生物动物疫苗技术领域，尤其涉及一株低毒力猪源脑心肌炎病毒,将猪脑心肌炎病毒毒株的全长cDNA置于CMV启动子控制下，采用DNA转染系统拯救病毒，获得重组病毒，方法简便易行，成功建立该病毒cDNA感染性克隆，拯救获得病毒，体外复制特性与原始病毒相似，但对小鼠致病性明显减弱，为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础；本申请得到的低毒力猪源脑心肌炎病毒经灭活后制备成疫苗，保护率高达90%，是一种安全且保护率高的灭活疫苗。
【IPC分类】A61P31/14, C12N7/01, A61K39/125
【公开号】CN105647877
【申请号】
【发明人】白娟, 方谱县, 姜平
【申请人】南京农业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月2日