节青霉素(浓度为l〇〇mg/ml)抗性的lml LB的离心管中，于37°C 200rpm/min的摇床作 用5h左右。
[0103] (2)分别用移液枪吸取lyL菌液作为模板，利用M13正向引物和片段的特异性下游 引物进行菌液PCR反应，体系为25yL。
[0104] (3 )PCR扩增条件为:95 °C预变性5min; 95 °C变性30s，58 °C退火30s，72 °C延伸（时间 根据片段大小调整)进行30个循环;最后72°C延伸5min。
[0105] (4)取适量的PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，利用凝胶成像仪拍照，观察特 异性条带大小。
[0106] (5)如果出现较亮的特异性条带，初步验证该菌液含有阳性重组质粒。
[0107] 2.5.4重组质粒的小量提取
[0108]取上述含有阳性重组质粒的菌液20~30yL菌液，接种于含有卡那或氨苄青霉素 (浓度为1 〇〇mg/m 1)的5m 1 LB，置于37 °C 20Orpm/miη转速的摇床继续培养12-16h，按照 PlasmidMiniPrep Kit试剂盒的方法提取质粒，分别命名为pEasy-A、pEasy-B、pEasy-C，并 送公司测序。具体步骤如下：
[0109] (1)将5ml菌液分两次离心，10000rmp/min，弃掉上清液。
[0110] (2)加入250yL Buffer A(使用前需加入RNaseA)，将沉淀于EP管底部的菌体用移 液枪反复吹打重悬。
[0111] (3)加入250yL Buffer B，将EP管反复轻柔地颠倒10次左右使其混合均匀，然后室 温静置5min，直至溶液粘稠而澄清。
[0112] (4)再加入350yL Buffer N，立即将混合液多次上下反转，使溶液混合均匀，此时 会出现白色絮状沉淀。
[0113] (5)将EP管置于高速离心机中，13000rmp/min室温离心10min，直至上清中不含白 色沉淀，如有少量沉淀漂浮于其中，可再次离心。
[0114] ( 6 )将离心后的上清液小心转移至带有收集管的D N A柱中，避免吸起沉淀， 13000rmp/min室温离心lmin，弃去收集管中的液体，离心柱重新放回收集管中。
[0115] (7)向柱中加入500yL Buffer KB，13000rmp/min室温离心lmin，弃去滤液，将离心 柱放回收集管中。
[0116] (8)加入500yL DNA Wash buffer，13000rmp/min室温离心lmin，弃去滤液，将离心 柱放回收集管中，重复步骤8。
[0117] (9)13000rmp/min室温开盖离心5min，彻底清除乙醇
[0118] (10)将离心柱置于一个新的1.5ml EP管中，向DNA柱膜中间加入50~100yL的 ddH2〇或Elution Buffer(经50°C预热），室温静置2min，13000rmp/min离心lmin，再将洗脱 液加入离心柱中，13000rmp/min离心lmin，即可得更高浓度的质粒，经紫外分光光度计测定 其浓度，并于_20°C保存备用。
[0119] 2.6病毒全长cDNA克隆的构建与基因测序结果
[0120] 按照图1的策略构建全长cDNA克隆。首先，pEasy-C质粒用PacI和Spel双酶切，构建 连接体系利用T4连接酶将片段C克隆至用同样酶切处理的的载体CMV-β，22 °C连接5h，转化 Transl-Tl感受态细胞，获得的阳性质粒命名为pCMV-C，经测序正确后保存该质粒及菌液。
[0121] 然后pEasy-B质粒经PacI和Xhol双酶切，将酶切纯化后的B片段与PacI和Xhol双酶 切后的PCMV-C载体连接，获得阳性质粒命名为pCMV-BC，测序正确后保存质粒和菌液。采用 同样的方式将A片段连入pCMV-BC载体中，最后获得含EMCV NJ08株基因组全长的cDNA克隆， 命名为PCMV-NJ08,经酶切鉴定正确后采用紫外分光光度计测定浓度，并保存于-20°C备用。
[0122] 全长质粒pCMV-NJ08经Xho I和Nhe I双酶切鉴定，酶切产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分 析证明获得含了EMCV NJ08株基因组全长cDNA的克隆pCMV-NJ08,大小约为11.2kb。全长质 粒测序结果（图3)表明5,非编码区（5'UTR)的Poly(C)可读长度为10nt，基因组3'末端的 Poly(A)为15个腺嘌呤核苷酸，与EMCV NJ08登陆GenBank序列比对见表3。
[0123] 表3全长cDNA与EMCV NJ08基因组序列比对
[0124]
[0125] a表示核苷酸位置及序列参考EMCV NJ08毒株(GenBank收录号:HM641897).
[0126] |3表示沉默突变产生一个EcoRI限制性内切酶作为遗传标记，鉴定拯救病毒（图1).
[0127] 2.7全长cDNA克隆的转染及病毒拯救
[0128] 将BHK-21细胞接种六孔细胞板，置于37°C、5%C02的温箱中过夜培养;待细胞板中 的BHK-21单层细胞长至80 %左右，按照Lipof ectamine?2000转染试剂说明书进行操作。具 体步骤如下：
[0129] (1)取出六细胞孔板，小心吸出细胞上清，并用不含血清的DMEM培养液洗涤1~2 次，放回温箱。
[0130] (2)利用EP管构建两个体系:a将2yg重组质粒pCMV-NJ08加入到含有500yL的EP管 中；b将3.5yL脂质体加入含有500yL DMEM培养液的EP管中，用移液枪轻柔吹打混匀，室温静 置 5min
[0131] (3)将步骤2中的两个反应体系混匀，室温静置20min。
[0132] (4)取出细胞板，弃去细胞上清，加入上述质粒和脂质体的混合液，置于37°C、5% C02的温箱中培养5h。
[0133] (5)弃去转染液，换成含2 %胎牛血清的无抗生素 DMEM培养液继续培养。
[0134] (6)每隔一段时间对其观察，待出现细胞病变(CPE)且细胞大部分脱落时便可以收 取病毒，作为第一代病毒，命名为rNJ08，于-70°C保存备用。
[0135] 3拯救病毒鉴定
[0136] 3.1拯救病毒滴度测定
[0137] 取长有BHK-21单层细胞的96孔细胞板，用含2%胎牛血清的DMEM培养液(维持液） 对rNJ08进行10倍梯度稀释，选取稀释度为10- 4-10-12的病毒液接种BHK-21细胞;每个稀释 度重复接种4孔，每孔接种100yL;同时设立阴性对照，加入100yL维持液置于37°C、5 %C02的 温箱中继续培养。48h左右观察细胞病变，按照Reed-Muench法计算病毒TCID 50。
[0138] 将重组质粒pCMV-NJ08转染BHK21细胞后培养24h，即可观察到明显的CPE，与亲本 病毒感染产生的CPE无差异，主要表现为细胞圆缩、细胞崩解成碎片直至脱落（图4)。将转染 后产生拯救病毒的细胞培养液反复冻融三次，作为第一代，拯救病毒命名为rNJ08。将拯救 病毒接种BHK-21细胞，连续传代。对第3、5、10代拯救病毒的TCID 5Q进行测定，结果为107·66~ 108· 5TCID5Q/mL，与野生病毒滴度相似。
[0139] 3.2拯救病毒遗传标记的鉴定
[0140] 将单一的酶切位点EcoRI通过PCR方法引入至cDNA中，因此可用酶切方法区分亲本 病毒与拯救病毒。拯救病毒在BHK-21上传至第3代，细胞培养液反复冻融三次后提取总RNA， 以EcoRI-F/EcoRI-R为引物(表1)利用RT-PCR方法同时扩增拯救病毒和亲本病毒基因组 5921~6777bp区域。取经割胶回收纯化后的PCR产物，用EcoRI酶切初步确定该遗传标记；用 1.2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物及酶切产物进行分析，结果显示:野生毒的RT-PCR产 物经EcoRI单酶切不能产生两条条带，只得到唯一条带;而拯救病毒的RT-PCR产物经酶切后 产生了 535bp和322bp两个片段（图5)。将RT-PCR产物纯化后克隆至pMD19T载体中进行测序 分析，表明仅6243位点(A)与亲本病毒(T)不一样。将拯救病毒在BHK-21细胞上传至15代后， 分别对第5、10、15代拯救病毒进行遗传标记的鉴定，结果表明遗传标记能够稳定存在。
[0141] 3.3间接免疫荧光试验
[0142] 间接免疫荧光可用来检测位于BHK-21细胞中病毒表达的抗原蛋白。按常规方法操 作，即：取生长成良好的细胞单层的96孔细胞板，接种拯救病毒或亲本病毒100yL，同时设阴 性对照，加入l〇〇yL含2 %胎牛血清的DMEM营养液，继续培养12h，弃去细胞上清，用4°C预冷 的丙酮甲醛(体积比1:1)混合物-20 °C固定15min，PBS洗涤3次，操作需轻柔，防止细胞脱落。 加入100yL 1:100稀释的EMCV VP1单克隆抗体(4E2)，37°C作用lh;PBS冲洗3次。加入50yL 1:100稀释的FITC荧光标记羊抗鼠 IgG，37°C避光作用45分钟。PBS洗涤3次，每次5分钟;晾干 后于荧光显微镜下观察，结果显示：拯救病毒rNJ08和亲本病毒分别接种BHK-21单层细胞 12h后，感染细胞呈现可见的特异性荧光，而细胞对照组则未见特应性荧光（图6)。
[0143] 3.4病毒生长曲线
[0144] 将10代拯救病毒rNJ08与亲本病毒NJ08均按102'5TCID 5Q的病毒量分别接种BHK-21 单层细胞，加入2%DMEM维持液继续培养。每隔4小时取样，直至接种后28h。利用Reed-Muench法测定不同时间点收集病毒的TCID 5Q，每个病毒的每个时间点进行3次重复测定，根 据测定结果绘制病毒在BHK-21细胞上的生长曲线，结果见图7,表明rNJ08与NJ08在BHK-21 细胞上的增值曲线趋势相似，拯救病毒滴度略低于野生病毒。
[0145] 3.5病毒蚀斑试验
[0146] 将细胞瓶中的细胞经传代接种于6孔细胞板中，并于37°C、5%C02的温箱中过夜培 养，待6孔细胞板中BHK-21细胞长成80 %左右细胞单层时，弃去细胞培养板中的营养液，用 高压过的ros洗三次，洗去残留的营养液，拯救病毒组和亲本病毒组均接种100TCID 5Q的病 毒。设立阴性对照，每孔均为lmL，置于37°C、5%⑶2细胞培养箱中培养lh。然后弃去病毒液 后，用PBS洗3次，以洗去未吸附进入细胞的病毒。