DNA Polymerase贝勾自 Stratagene公司，TRIzol Reagent、SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase、Lipof ectamine?2〇OOReagent购自 Invitrogen公司；T4DNA连接酶，PacI、 NheI、XhoI、SpeI、EcoRI等限制性内切酶均购自NEB公司；DNA快速纯化/回收试剂盒购自北 京鼎国昌盛生物技术有限公司；Plasmid Miniprep kit购自BI0MIGA公司；DL15000DNA marker、DL5000DNA maker、DL2000DNA marker及pMD19-T载体均购自TaKaRa;EMCV VP1 单克 隆抗体4E2由本实验室制备；羊抗鼠 IgG-HRP、羊抗鼠 IgG-FITC抗体购自博士得生物工程公 司。其他试剂均为分析纯级产品。pEasy-simple Blunt cloning vector、DH5a感受态细胞 购自北京全式金技术有限公司。CMV-β载体由本实验室保存。二乙烯亚胺购自sigma公司；人 淋巴细胞分离液购自上海艾研生物科技公司；新生犊牛血清购自北京民海生物公司;RMPI-1640培养基购自Sigma公司；ISA206、ISA15A佐剂购自法国Sepic公司；羊抗鼠 IgG-HRP抗体 购自博士得生物工程公司。
[0060] 2重组病毒构建
[00611 2.1引物设计与合成
[0062] 根据EMCV NJ08株全基因组序列（GenBank HM641897)，设计11条引物，分别用来扩 增覆盖整个基因组的4个片段;其中包含一对酶切鉴定引物EcoRI-F/EcoRI-R，用于RT-PCR 扩增，酶切扩增产物鉴定C片段中引入的EcoR頂每切位点(第6243位的T变成A，突变后与突变 前密码子均编码同一氨基酸(Arg)，为同义突变），识别序列为GAATTC，作为感染性克隆的遗 传标记，以便与亲代病毒相区别。以上引物都由上海英骏生物技术有限公司合成，并按照其 弓丨物的量用ddH 20稀释到一定浓度。具体引物序列见表1。
[0063] 表1 EMCV NJ08基因组全长cDNA的扩增及鉴定用引物
[0064]
Luuw」°柑体卜划线表不限制丨生内切鰣识別序列；拈亏表不相奴的内切?;
[0066] 巧女字表示EMCV NJ08基因组对应的核苷酸位置(GenBank收录号:ΗΜ641897)
[0067] 2.2病毒总1?熟的提取
[0068] 将EMCV NJ08株接种ΒΗΚ-21，待80%的细胞出现病变时收获病毒。将细胞毒反复冻 融3次，按照TRIzol说明书提取EMCV的总RNA。所用的耗材需经过DEPC水以及高压灭菌处理。 实验操作时必须带上一次性医用口罩和乳胶手套，尽量保持在低温环境中进行。具体步骤 如下：
[0069] (1)将收获的细胞病毒液(反复冻融三次)室温4000rpm离心5min，取离心后的病毒 上清液200yL置于1.5ml的EP管，并与800yL TRIzol试剂涡悬混匀，室温静置5min
[0070] (2)加入200yL的氯仿，用手反复震荡30s;室温静置5min;4°C12000rmp/min离心 15min
[0071] (3)此时混合液分为三层，取最上层的水相层于新的1.5ml EP管中（切勿吸到白色 沉淀）；加入等体积的异丙醇，并混勾，室温静置1〇111；[11，4<€120001'11^|/1]1；[11离心101]1；[11
[0072] (4)小心弃去上清，并倒扣于吸水纸上保证上清弃除干净，然后加入lmL75%乙醇， 4°C7500rmp/min 离心 5min
[0073] (5)将上清弃除干净，EP管盖敞开，使沉淀物晾干（室温5-10min);最后加入10yL DEPC水冰上溶解5min，所得溶液即为RNA，置于-70 °C保存备用。
[0074] 2.3RT-PCR扩增目的基因片段
[0075]将上述提取的病毒总RNA作为模板，以六1?』11?』21?、以及0?1为特异性下游引物，按 照SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase反转录酶的说明书，构建反应体系可获得高 浓度的六1、82、(：片段的〇0嫩。分别以六?/^，8疋/8此8#/8 21?，0?/0?2为引物，相应的〇0嫩为 模板进行PCR反应，获得六^:^:^丄四个片段:扩增产物经^^琼脂糖凝胶电泳鉴定煻明交回 收目的条带；然后利fflMVBsR为引物，将回收纯化后的BdPB 2片段进行融合反应，获得B片 段。
[0076] 使用SuperscriptTMIII Reverse Transcriptase进行反转录合成cDNA:模板RNA 12yL，特异性下游引物lyL，10mM dNTPs lyL，体系混匀后，置于65°C水浴作用5min，然后立 刻冰浴 3min;参照使用说明书补加 4yL 5XFirst_strand buffer、lyL0.1M DTT、lyL Superscript? III Reverse Transcriptase，将上述两体系混合均勾，短暂离心使管壁上 的液体全部聚集于EP管底。55°C水浴温育lh，然后70°C水浴15min。最后获得相应片段的 cDNA，保存于-20°C备用。
[0077] 以上述反转录得到的cDNA为模板，参照Pfu Ultra? II Fusion HS DNA Polymerase产品说明书进行PCR扩增反应，体系为25yL:上、下游引物各lyL，10 XPfuUltra Ilreaction Buffer 2.5yL，2.5mM dNTP mixture 2.5yL，模板cDNA2yL，ddH2〇 15.5yL，Pfu Ultra? II Fusion HS DNA Polymerase 15·5μΙ^ΡΟ?反应条件为：预变性温度95°C，2min; 变性温度为95 °C，Tm°C退火20s，延伸温度72 °C 30s/kb，终延伸72 °C 5min。
[0078] PCR反应退火温度及延伸时间与扩增片段的长度以及引物的Tm值有关，以下为扩 增每个片段所选择的退火温度及延伸时间(表2)。
[0079] 表2每个片段对应的退火温度和延伸时间
[0080]
[0081 ]反应结束后，取适量PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0082] 81与出片段融合反应的体系为：BiF 0.5yL，B2R O.SyUBi 0.6yL，B2 1.4yL，2.5mM dNTPs 2.5yLa〇XPfuUltranreaction Buffer 2.5yL,Pfu Ultra? II Fusion HS DNA Polymerase 0.5yL。反应条件为：预变性温度95°C2min;变性温度95°C20s，退火温度58°C 20s，延伸温度72°C3.5min进行35个循环;终延伸72°C5min。取适量PCR产物经1.0%琼脂糖 凝胶电泳鉴定，若为目的条带则将剩余样品全部回收纯化。
[0083] 以四个片段的特异性下游引物反转录获得cDNA片段，然后以其为模板进行PCR反 应得到预期大小的四个片段，分别为六、8 132、(：片段，其中也和出片段通过融合?0?过程扩增 获得B片段，获得3个片段大小分别约为1120bp、5 lllbp、1556bp，用1 %琼脂糖凝胶电泳进行 分析，扩增条带与预期相符(见图2)。扩增片段经DNA快速纯化/回收，克隆至pEasy-Simple Blunt载体中测序正确。
[0084] 2.4PCR产物回收与纯化
[0085] 参照DNA快速回收/纯化试剂盒的说明方法将扩增获得的目的片段纯化，具体操作 如下：
[0086] (1)在紫外灯下，用刀片切取含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块，尽量弃去多余的琼 脂糖凝胶，置于空EP管，按照1:3重量比（即100mg凝胶块加入300yL溶液A)加溶液A。
[0087] (2) 55-60 °C水浴1 Omin左右，使凝胶块完全溶化，其间需振荡2-3次以便加速溶化。
[0088] (3)加入50yL溶液B，振荡混匀，检验溶液A是否够量。
[0089] (4)将上述混合液转移至离心柱中，静置2min，12000rmp/min离心30s，如果一次加 不完，可分两次离心。
[0090] (5)弃去收集管中的液体，加入500yL溶液C(使用前需向溶液C中加入100ml无水乙 醇)于离心柱中，12000rmp/min离心30s，再弃去收集管中的液体，重复该步骤。
[0091 ] (6)12000rmp/min空离lmin，甩干剩余的液体以除去残余酒精;将离心柱置于新的 EP管中，室温敞开EP管盖5-10min，使酒精完全挥发。
[0092] (7)加入20-60yL已预热的溶液D或双蒸水（50°C左右），室温静置2min;12000rmp/ min离心2min，EP管底溶液即为所需的DNA，使用紫外分光光度计测定其浓度，置于-20°C保 存备用。
[0093] 2.5EMCV中间载体的构建 [0094] 2.5.1目的基因片段与载体的连接
[0095]反应体系为5yL。将回收的各目的片段分别与pEasy-simple Blunt克隆载体进行 连接，体系为:PCR产物4yL，pEasy_simple Blunt cloning vector lyL。手指轻弹混勾后， 按照说明书推荐的最佳反应温度25°C连接作用30min。连接产物即可用或置于-20°C保存 备用。
[0096] 2.5.2转化感受态细胞
[0097] (1)在无菌操作台中，用移液器吸取5yL连接产物至50yL Transl-Tl感受态细胞中 (保证体积比1:1)，手指轻弹管壁混匀，置于冰浴中30min。
[0098] (2)放入42 °C水浴中热激45s，迅速置于冰上2min。
[0099] (3)加入800yL不含抗生素的LB液体培养基，置于37°C，200rmp/min的摇床中温育 45min〇
[0100] (4)12000rpm离心lmin，移去部分上清液，余留大约100yL液体将沉淀物重悬，并均 匀涂布于含有卡那/氨苄青霉素抗性的LB平板上，倒置于37°C恒温箱中培养过夜。
[0101] 2.5.3阳性重组子的鉴定
[0102] (1)待平板上长出合适大小的单菌落，用小枪头挑取4-6个单菌落分别接种于含卡 那/氨