加入含8%DMEM与2%低熔点琼脂糖等体积 混合物，每孔2mL，置于37 °C、5 %⑶:^细胞培养箱中培养大约24h。之后每孔加入约lmLl %的 结晶紫染液，置于37°C、5%C02细胞培养箱中培养，3h后取出6孔细胞培养板加去离子水洗 净后甩去凝胶，晾干后观察空斑数及其大小形态，结果显示:拯救病毒和野生病毒在BHK-21 细胞上形成蚀斑的数量、大小、形态很相似(图8)。
[0147] 4拯救病毒小鼠致病性试验
[0148] 将30只6周龄的雌性BALB/c小鼠，随机分成3组，每组10只；其中2组作为攻毒组，分 别注射第5代拯救病毒rNJ08和野生毒NJ08，每只小鼠腹腔注射100yL病毒液，总量均为1 X IOUtCIDm。第3组作为对照组，腹腔注射100yL 2%DMEM细胞维持液，并保证每组分开饲养， 观察临床症状和病理变化，14天后处死所有活的小鼠，收集所有小鼠脑组织样品(含发病死 亡小鼠），利用免疫组织化学方法检测病毒在脑组织中的分布，应用Taq-Man Real-time PCR方法对脑组织中的病毒含量进行检测。
[0149] 4.1临床症状与病理变化
[0150] 亲本病毒组小鼠在攻毒后第5天出现了明显的临床症状，主要表现为精神沉郁、流 泪、蜷缩、被毛粗乱、呼吸急促，并表现出明显的的精神症状，如后肢麻痹瘫痪、震颤、转圈 等，接种7天后小鼠全部死亡。剖检后可发现小鼠肺脏出血充血严重，慢性死亡的小鼠心脏 可见白色坏死斑，脑组织充血水肿。拯救病毒组第6天有3只小鼠出现临床症状，后肢麻痹瘫 痪，行走不便，但是一直未出现小鼠死亡，能缓慢恢复，剖检小鼠病变较轻微。与亲本病毒 相比，拯救病毒对小鼠的致病性和毒力表现出显著性差异。对照组小鼠全部健活(图9)。
[0151] 4.2免疫组化检测病毒
[0152] 采集死亡小鼠及存活小鼠的脑组织，并去其脑膜，置于4%多聚甲醛溶液中固定 24h，然后制作组织切片，滴加抗EMCV VP1单克隆抗体(1:100稀释），进行免疫组化试验分析 病毒在脑组织中分布情况，结果显示:拯救病毒和亲本病毒存在于脑组织中（图10)，说明拯 救病毒和亲本病毒都能在脑组织中复制。
[0153] 4.3Real_time PCR检测EMCV
[0154] 每组随机挑选5只小鼠，取其相同质量的脑组织样品，按照TRIzol说明书进行操 作，具体步骤见1.2.2。以0118〇(1(1')18为反转录引物，上述提取的基因组1?^作为模板，按照 M-MLV反转录酶(Promega)说明书操作反转录反应，反应体系为:5XBuffer 4yL，dNTPs 0.5 41^，01丨8〇(1(1')181以1^，病毒总1?祖14以1^-]\11^0.5以1^。先将体系中前四项样品混匀，并短暂 离心使管壁液体聚集管底，然后70°C水浴作用5~10min;立刻取出样品置于冰上作用2min， 再加入M-MLV 0.5ul，轻弹混匀后，短暂离心，37 °C水浴lh，即可获得cDNA，-20 °C保存备用。 SYBR GreenI实时PCR反应体系为：取上述的cDNA 2yL，上下游各1.5yL，2XPowerSYBR Green I PCR MasterMix 10yL，ddH20 5yL。置于ABI 7300real-time PCR仪中进行反应，程 序为:预变性温度95 °C 2min，变性温度95 °C 15s，退火温度60 °C lmin，进行40个循环。同时设 定阴性对照。结果显示，拯救病毒在小鼠体内的复制能力明显弱于亲本病毒(图11)。
[0155] 5疫苗制备
[0156] 5.1病毒增殖
[0157] 将多瓶生长状态良好的BHK-21单层细胞用D-Hank's溶液洗涤2-3次;弃去洗液，加 入100yL EMCV rNJ08(第10代）或NJ08病毒液，37°C作用lh，弃去细胞上清，加入10mL2% DMEM维持液，放回37 °C细胞培养箱继续培养，待80 %左右的细胞出现细胞病变即可收获，将 细胞液反复冻融2-3次，4000rpm/min离心5min，收集细胞上清，并测定细胞上清病毒含量， 于-70°C保存备用。
[0158] 5.2病毒滴度测定
[0159] 用含2%胎牛血清的DMEM(维持液)将上述保存的rNJ08或NJ08病毒液进行10倍梯 度稀释，选取稀释度为10_4-10_ 12的病毒液接种96孔细胞板;每个稀释度重复接种4孔，每孔 接种100yL;同时设立阴性对照。将96孔细胞板密封好，37 °C作用lh后，将接种物小心弃去， 再加入l〇〇yL维持液置于37°C、5%C02的温箱中继续培养。48h左右观察细胞病变，按照 Reed-Muench 法计算病毒 TCIDso。结果为:rNJ08TCID5〇 为 10-8· 12/mL，NJ08TCID5Q 为 10-9· °/mL。
[0160] 5.3病毒灭活条件
[0161] 灭活条件，BEI浓度为0.002mol/L、28°C作用24h可将病毒完全灭活。
[0162] 5.4疫苗配制
[0163] 3.4.1不同佐剂灭活疫苗:将灭活的冰几8和町08使用154154和15六206佐剂分别配 制成灭活疫苗。使用ISA15A和ISA206两种佐剂分别将灭活的NJ08和rNJ08配制成抗原浓度 均为 107TCID5〇/ml 的四种灭活疫苗（即 rNJ08/15A、rNJ08/206、NJ08/15A、NJ08/206)，疫苗物 理性质符合要求。两种佐剂与病毒抗原量用量比例如下：
[0164] 第一种：ISA15A佐剂与抗原量为1:4,即ISA 15A佐剂7.5ml，灭活抗原25ml，用生理 盐水补齐至50mL。
[0165] 第二种：ISA206佐剂与抗原量比例为1:1，即ISA 206佐剂25ml，灭活抗原25ml。 ISA206疫苗外观呈乳白色，均质乳剂，4°C保存2个月无分层及破乳现象，滴入水中呈油滴状 不易扩散;ISA15A为水佐剂，呈淡粉红色的均质悬液。4 °C保存时间较长，滴入水中可与水混 溶。
[0166] 3.4.2不同抗原含量疫苗配制：将冰卯8配制成每毫升含毒量为107' ()、106'()、105'()、 IO^TCIDm，加入等量ISA 206佐剂，混合均匀即可，4种疫苗命名为高剂量、中剂量、低剂量、 超低剂量疫苗，疫苗物理性质符合要求。
[0167] 6.疫苗免疫保护试验
[0168] 6.1不同佐剂灭活疫苗小鼠免疫保护试验
[0169] 将7 5只6周龄ICR小鼠随机分成5组，每组15只。第1、2组分别皮下注射由I SA 15A佐 剂配制的灭活疫苗rNJ08/15A和NJ08/15A(抗原浓度均为107TCID50/0.2ml)，第3、4组分别 皮下注射由ISA206佐剂配制的rNJ08/206和NJ08/206(抗原浓度均为10 7TCID50/0.2ml)。第 5组皮下注射2%DMEM作为阴性对照。采用皮下多点注射，0.2ml/只，免疫两次，间隔3周;首 免后3周，对小鼠尾尖采血，测定ELISA抗体水平。加强免疫后3周，每组随机选取5只小鼠进 行眼球采血，测定ELISA抗体以及中和抗体效价；同时将其脾脏取出，分离淋巴细胞进行淋 巴细胞增殖转化试验测定细胞免疫水平。各组剩余的10只小鼠进行攻毒保护试验，每只小 鼠攻毒剂量为〇.lml(NJ08株，10 6TCID50/mL，腹腔注射），均隔离饲养观察，每天记录小鼠发 病及死亡情况。攻毒后21天进行剖杀，观察记录病理变化。
[0170] 结果为:对照组小鼠在攻毒后3~5天均出现明显临床症状，主要表现为精神沉郁、 被毛粗乱、弓背及后肢麻痹等神经症状。各组攻毒保护率统计结果见图16,佐剂ISA206组小 鼠存活率达到了 100%，ISA15A组存活率为80%，说明ISA206佐剂效果更好，而空白对照死 亡率为100%。
[0171] 6.2不同抗原含量疫苗小鼠免疫保护试验
[0172] 将75只6周龄ICR小鼠随机分成5组，每组15只。第1~4组分别皮下多点注射等体积 的由 ISA15A佐剂配制的梯度抗原浓度（107TCID50/0 · 2ml、106TCID50/0 · 2ml、105TCID50/ 0.2ml、104TCID50/0.2ml)的rNJ08灭活疫苗。第5组皮下注射2%DMEM作为阴性对照(0.2ml/ 只）。首免后3周，对小鼠尾尖采血，测定ELISA抗体水平，同时进行加强免疫，免疫剂量和方 法同首免。加强免疫后3周，每组随机选取5只小鼠进行眼球采血，测定其ELISA抗体以及中 和抗体效价；同时将其脾脏取出，分离淋巴细胞进行淋巴细胞增殖转化试验测定细胞免疫 水平。各组剩余的10只小鼠进行攻毒保护试验，每只小鼠攻毒剂量为O.lml (NJ08株， 106TCID50/mL，腹腔注射），均隔离饲养观察，每天记录小鼠发病及死亡情况。攻毒后21天进 行剖杀，观察记录病理变化。
[0173] 结果发现，攻毒后3~5天对照组及接种较低剂量组小鼠出现明显临床症状，症状 同3.5所述。不同抗原含量（即高剂量、中剂量、低剂量、超低剂量)疫苗小鼠保护率分别为 100%、100%、80%、40%，而空白对照死亡率为100%，结果见图17。
[0174] 6.3ELISA抗体水平的测定
[0175] 参照一般操作方法，具体步骤如下：
[0176] (1)将纯化的EMCV VP1重组蛋白（由本实验室保存）用抗原包被液稀释成2.0yg/ mL，每孔100yL，37°C作用2h，然后4°C过夜。
[0177] (2)弃去抗原包被液，每孔加入200yL的5 %脱脂乳，37 °C封闭2h。
[0178] (3)弃去脱脂乳，PBS清洗2~3次，每次5min，将其拍干。
[0179] (4)将小鼠血清从1:100进行2倍梯度稀释，每孔lOOyL血清稀释液，同时设立阴性 对照，37°C孵育lh。
[0180] (5)弃血清，PBS清洗2~3次，每次5min，将其拍干，每孔加入羊抗小鼠 IgG-HRP (PBST稀释成 1:10000)，37°C孵育30min。
[0181] (6)弃去液体，PBS洗涤2~3次，将其拍干使每孔水分完全弃除，每孔加入100yL TMB显色液，室温显色5-10min。
[0182] (7)加入50yL的2M H2S〇4终止反应，测定其ODASOnnuP/N值^2.1的最高稀释度为该 血清的抗体滴度。并通过Spass软件分析比较各组之间是否存在差异。
[0183] 首免后3周，各免疫组都能