2013,8(8): e70778)〇
[0037]关于其它启动子和转录因子的载体构建过程如下。首先，利用新型植物基因组提 取试剂盒（天根生化科技有限公司）抽提箭叶淫羊藿幼嫩叶片的基因组DNA;利用RNAiso Plu s试剂(Takara公司）抽提拟南芥哥伦比亚生态型幼嫩叶片的总RNA;利用凝胶电泳和Na noDrop 2000仪器检测核酸的质量和浓度。拟南芥叶片总RNA按照实施例2中的反转录方法 合成相应的cDNA模版，置于-20°C待用。以箭叶淫羊藿基因组DNA为模版，高保真的 PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司）扩增EsCHS，EsF3H，EsFLS和EsDFR2的启动子 序列，所用引物分别为ProEsCHS · F: 5 ' -ACATGTGTGGATTTGGCTTAACG-3 ' TTAGCTCTTACTGTTATTATTTATCACG-3 '；ProEsF3H·F:5 '-CTCCGCAATCTCCATACATTCGTC-3 ' 和 ProEsF3H.R：5，-TGCGGGTTAATAGTTTGTTTCCT-3，；ProEsFLS.F：5 ，-GTAGGTTTTGAGACTCACAGTAGGTGC-3 ' 和ProEsFLS·R:5 '-GAAACTTTGGTGTTTTCTTCTTCTTCTC-3 ' ；ProEsDFR2·F:5 '-ATCTCAAAATTACCTTTCGTTGCTA-3 ' 和ProEsDFR2·R:5 '-TTCTTAAGGATGGTGTTAATTGTGAC-3'。以结构基因起始密码子为起点，EsCHS、EsF3H、EsFLS和 EsDFR2的启动子序列长度分别为718bp，1772bp，624bp和1138bp。经过PCR扩增后，先将目的 启动子序列克隆到pMD19_T(Takara公司）载体上，并送公司测序。挑取测序正确的方向正确 的克隆抽提质粒，用Kpn I/Pst I双酶切，将启动子片段转移至经过同样酶切的pGreen II 0800-LUC载体中，并对得到的重组质粒进行PCR和酶切筛选，并测序鉴定。最后，抽提测序正 确的重组质粒DNA备用。同时，先利用高保真PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司） 和拟南芥cDNA模版扩增AtMYB12(Accession N〇:NM_130314.3)的0RF，然后克隆到pMD19-T 载体中，并测序验证。AtMYB12 0RF扩增所用引物序列为5 ' -ATGGGAAGAGCGCCATGTTGC-3 '和 5 '-TCATGACAGAAGCCAAGCGACCAA-3 '。对于EsMYBFl转录因子而言，直接使用实施例1中分离 得到的含有EsMYBFl全长的pMD19-T重组质粒。利用双酶切Pst Ι/Κρη I和Xba I/Sal I分别 将AtMYB12的0RF和EsMYBFl的全长cDNA转移到pGreen II 62-SK激活载体中。再对获得的重 组质粒通过PCR、双酶切和测序鉴定，并抽提测序正确的重组质粒DNA备用。最后，通过电击 转化方法将构建好的报告载体和激活载体导入到农杆菌菌株GV3101中，在25mg/L利福平 (Rifampicin，简写Rif，下同）和25mg/L庆大霉素（Gentamicin)以及50mg/L卡那霉素 (Kanamycin，简写Kan，下同）等抗生素下进行筛选，并通过菌液PCR确认转化成功。值得注意 的是，在pGreen II系列质粒DNA转化至农杆菌中时，必须连同辅助质粒pSoup-起共转，否 则pGreen II不能在农杆菌中存活。
[0038] 农杆菌浸染本式烟草的方法也参考上述有关双荧光素酶分析所用载体发明和应 用的文献，具体过程如下:本式烟草种植于温室中，22°C和自然光线下生长。当植株生长到6 片叶子时，选择超过lcm的幼嫩叶片作为浸染的对象。挑含有重组质粒的农杆菌GV3101单克 隆于LB培养基(加有50mg/L Kan)中，28°C过夜培养16-24h，然后离心收集菌体。再用一定体 积的浸染液（l〇mM MgCl2,0.5μΜ乙酰丁香酮（acetosyringone))悬浮，使其0D6QQ达到0 · 2_ 0.3,在室温下放置2h后准备浸染。按照100yL含有报告载体的农杆菌和900yL含有激活载体 (如果有两个转录因子共转的话，各取450yL)的农杆菌菌液混合作为浸染工程菌。使用无针 头注射器注射到幼叶上，每片叶片注射2-3个点，每棵植株处理3-4片叶片。每个处理至少有 四棵独立的植株作为重复。在温室条件下，生长3_4days后，收集注射过的叶片部位，准备下 一步的双荧光检测。
[0039] 利用Dual Luciferase Reporter Assay System试剂盒（Promega公司）测定瞬间 转化本式烟草叶片中萤火虫焚光素酶（firefly luciferase)和海肾焚光素酶(reni 11a luciferase)的活力。具体操作过程如下:在浸染3_4days后，用叶片打孔器收集大小为lcm 的小叶盘，置于500yL裂解液(Passive lysis buffer)中研磨，然后取10yL以1/100稀释过 的粗提液置于40yL Luciferase Assay Buffer中测定焚光强度；然后再加40yL Stop and Glow buffer，再次测量焚光强度，并将两者的比值(Luc/Ren ratio)作为衡量转录因子对 启动子激活能力的大小指标。使用的焚光检测仪为GloMax 20/20(promega公司）。每个处理 至少包含4棵独立植株，实验重复三次。仅使用含有启动子的报告载体处理(没有转录因子 存在)的植株作为背景对照。某些情况下，使用功能已知的AtMYB12作为阳性对照。瞬间双荧 光素酶分析实验表明EsMYBFl基因具有激活结构基因 EsF3H和EsFLS启动子的能力，但对 EsCHS，EsDFRs和EsANS启动子不具有激活能力;并且EsMYBFl和EsTT8或者AtTT8bHLH调控蛋 白不存在互作关系（图3)。
[0040] 实施例4:超量表达转基因验证基因功能
[0041]为了进一步验证EsMYBFl具有调控黄酮醇合成途径的功能，我们利用农杆菌介导 的遗传转化方法将EsMYBFl基因超量表达于烟草中，然后分析转基因烟草后代植株的表型 变化、类黄酮成分变化、以及类黄酮相关基因的表达变化等。转基因功能验证大致如下。
[0042] 1.超量表达载体构建及农杆菌介导的烟草遗传转化
[0043] 用于EsMYBFl基因超量表达的载体为双元表达载体pMV，它经双元表达载体pBI121 改造而来，内含CaMV 35S_truncated⑶S-Tnos表达框，由华中农业大学张俊红博士惠赠。 具体来源参见文献(张俊红。番茄Aux/IAA基因的克隆与功能分析。博士学位论文。武汉:华 中农业大学，2006)。首先，通过双酶切Sal I/Sac I将实施例1中包含有EsMYBFl全长cDNA的 PMD19-T重组质粒中的EsMYBFl全长cDNA转移到经过双酶切Xho I/Sac I的pMV表达载体，形 成超量表达载体pMV-EsMYBFl。其T-DNA区域示意图如图4所示，即是EsMYBFl全长cDNA替换 掉pMV载体中的truncated⑶S，并将其置于CaMV 35S启动子之下。然后，对此超量表达载体 的质粒DNA进行酶切和PCR鉴定，并测序验证。最后，将测序正确的重组质粒DNA通过电击转 化方法导入到农杆菌菌株EHA105中，用于下一步的烟草遗传转化。同时，也将空载体pMV导 入到农杆菌EHA105中，作为后续转化实验的对照。
[0044]遗传转化所用烟草品种为NC89,由北京林业大学戴思兰教授惠赠。农杆菌介导的 烟草遗传转化方法采用叶盘法（Horsch R,Fry J,Hoffmann N，Eichholtz D,Rogers SG, Fraley R. A simple and general method for transferring genes into plants · Science，1985，227:1229)。将超量表达载体pMV-EsMYBFl和空载体pMV转入到烟草 中的转化过程大致如下。首先，制备农杆菌工程菌液，将含有pMV-EsMYBFl重组载体或pMV空 载体的农杆菌EHA105涂皿于LB固体平板（带有25mg/L Rif和50mg/L Kan)，28°C培养2-3day，形成单克隆后保存平板于4°C备用，每两周划线复活。挑单克隆于5mL液体LB培养基中 (加有25mg/L Rif和50mg/L Kan)，一般培养36-48h，调整0D6QQ到0 · 8-1 · 2左右，即成浸染的 工程菌液。然后，收集无菌烟草的幼叶，切成lcm左右的小块，浸泡于农杆菌工程菌液中，时 间8-10min左右，然后取出叶片，在滤纸上晾干，然后转入共培养基(MS+6-BA lmg/L+NAA 0. lmg/L)中，黑暗条件下培养2天。其次，再转移到选择培养基(MS+6-BA lmg/L+NAA 0. lmg/ L+Kan 200mg/L+Cef 300mg/L)上(Cefotaxime，头孢霉素，简写为Cef)，每两周继代一次，直 至分化出抗性芽。最后，将抗性芽转移到生根培养基（1/2MS+Kan 2